Vídeo Bioinformática Análise de Crescimento Humano embrionárias Colony Stem Cell

Este protocolo demonstra um método de bioinformática de vídeo para medir o crescimento de colônias de células-tronco embrionárias humanas por meio da análise de vídeos com lapso de tempo coletados em um incubador estação bio CT, equipado com uma câmera para aquisição de imagens em vídeo. Colônias de células-tronco embrionárias humanas, ou colônias de HESC, são cultivadas até atingirem 70% de confluência, replantadas e incubadas por 48 horas, após as quais as colônias de HESC são filmadas por mais 48 horas no Biot ct. A taxa de crescimento é determinada utilizando receitas de segmentação, realce e medição desenvolvidas com o software CL quant.

As receitas são validadas por meio de comparação com o Adobe Photoshop, uma ferramenta de análise de imagem que permite o ajuste manual preciso de máscaras para cada colônia. O campo emergente da video bioinformática pode ser usado para automatizar o processamento, análise e mineração de dados biológ游戏副本

Olá, eu sou Sean Fino, também do Laboratório Talbot. Olá, eu sou TI Satish do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular, Molecular e do Desenvolvimento. Hoje vamos mostrar como medir o crescimento de colônias de células-tronco embrionárias humanas utilizando ferramentas de bioinformática em vídeo.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para medir os efeitos de toxicantes ambientais no comportamento de células-tronco embrionárias humanas. Vamos demonstrar este procedimento em nossa nova instalação central de células-tronco. Então, vamos começar.

Para preparar as HESC para análise em vídeo, cultive as HESC em placas de seis poços revestidas com Matrigel até atingirem 70% de confluência. Aspire o meio de um poço contendo HESC e lave duas vezes com um mililitro de PBS. Adicione um mililitro de Accutase e incube por um minuto a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Em seguida, adicione 10 a 12 esferas de vidro ao poço e agite suavemente a placa até que as colônias se soltem completamente.

Neutralize o Accutane utilizando um mililitro de meio de manutenção de células-tronco embrionárias humanas ou meio condicionado por fibroblastos embrionários de camundongo. Colete as células destacadas, sem as microesferas, em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 200 ×g durante três minutos. Decante o sobrenadante e ressuspenda o pellet com 500 microlitros de meio fresco de manutenção de células-tronco embrionárias humanas ou M-T-E-S-R. Plaque 100 microlitros da suspensão de CTEH gota a gota em múltiplos poços de uma placa de 12 poços revestida com Matrigel.

Balançar suavemente a placa para frente e para trás e observar as culturas em microscópio de luz para verificar se os agregados celulares estão uniformemente distribuídos pelos poços. Colocar a placa em um incubador a 37 graus e 5% de dióxido de carbono por 48 horas para garantir que as células estejam aderidas, planas e suficientemente grandes para serem facilmente visualizadas. Após 48 horas, aspirar o meio e lavar os poços com 500 microlitros de PBS para remover as células não aderidas, em seguida adicionar 500 microlitros de meio M-T-E-S-R a cada poço.

Imediatamente após, coloque a placa no Biot CT e comece a coletar imagens em lapso de tempo. Tente selecionar campos com colônias simples e bem definidas, que provavelmente não crescerão até se fundir com outras colônias. Neste protocolo, as células são gravadas em vídeo por mais 48 horas, com quadros a intervalos de sete minutos.

Para criar a receita de segmentação, primeiro, examine manualmente todo o vídeo para verificar se ele contém uma única colônia que permanece focada durante todo o período de gravação. Após isso, abra o assistente de segmentação no software CL quants e clique no botão próximo. Selecione o canal de imagem correto e clique no botão próximo.

Selecione correspondência suave e clique em Avançar. Escolha uma ou duas regiões desejadas circulando a borda externa até a área central da colônia. Esta área deve ser a menor possível, mas deve ser representativa de toda a colônia.

Não selecione muitas regiões, pois isso pode resultar em uma aplicação de máscara imprecisa. Clique no botão seguinte. Selecione as regiões indesejadas circulando áreas que não fazem parte da colônia nem do fundo.

Essas regiões apresentam padrões que devem ser suprimidos, como detritos e células mortas. Clique em próximo. Selecione o fundo circulando regiões que não são colônias, detritos ou células mortas.

O fundo deve ser uniforme e provavelmente aparecerá em todos os quadros. Normalmente, selecionamos o fundo cinza ao redor da colônia. Clique no botão seguinte.

Uma máscara colorida deve ser exibida sobre a região de interesse se a máscara não cobrir com precisão a região de interesse. O intervalo de limiar de segmentação no canto inferior direito da tela pode ser aumentado ou diminuído se for necessário alterar a máscara. Selecione atualizar regiões de correspondência suave.

Isso permite alterar as áreas desejadas, indesejadas ou de fundo. Se a máscara for satisfatória, selecione aplicar limite e salve minha máscara. Em seguida, clique no botão próximo.

A máscara será então exibida em uma cor diferente. Selecione finalizar. A receita deve ser exibida no canto superior direito do software como receita de segmentação.

Renomeie a receita, se desejar, clicando com o botão direito e inserindo um novo nome. Para aplicar a receita, clique com o botão direito e posicione o mouse sobre ela.

Aplicar a receita. Um menu aparecerá permitindo a seleção do número de quadros a serem usados. Defina o intervalo de quadros a cada 20 quadros para garantir a fidelidade da máscara.

Verifique aleatoriamente e manualmente 10% dos quadros aos quais a máscara foi aplicada para criar uma receita de realce que elimine regiões indesejadas em detritos. Clique com o botão direito na pasta da receita de realce e depois clique em novo. Uma nova receita de realce deve ser exibida a partir do campo original de visão.

Mova o mouse sobre os ícones na barra de ferramentas para identificar o botão de alternância do módulo de realce localizado à direita da imagem e clique nele. Selecione o menu suspenso de rotulagem. Selecione rotulagem para conectado, selecione rotulagem para conectado dois.

Uma nova barra de tarefas deve ser exibida. Pegue a máscara inicial da receita de segmentação e arraste-a para a caixa de entrada. A barra agora deve exibir o número da máscara de entrada.

Arraste o ícone com o número da máscara de entrada até o ícone da máscara zero. Localize o tamanho mínimo na barra de tarefas e ajuste o número até que somente a região de interesse seja exibida. Certifique-se de clicar em executar para cada tentativa de ajuste.

Uma vez que o ajuste de tamanho mínimo for satisfatório, clique na receita de realce anterior na parte inferior da tela e selecione salvar na receita. O software agora solicita a substituição da receita selecionada; escolha sim no ponto. Verifique a receita de realce utilizando o mesmo procedimento usado para verificação pontual da segmentação.

Se estiver satisfeito com as receitas de segmentação e realce, prossiga para criar o modelo de medição. Para começar, selecione criar modelo de medição na barra de ferramentas do lado direito. Na janela de medição, posicione o cursor sobre a figura da célula em clip art.

Mantenha pressionada a tecla controle e selecione a célula na seção de morfologia, desmarque o parâmetro padrão e marque o parâmetro de área. Em seguida, saia da janela de modelo. Selecione o ícone.

Crie uma receita de medição. Renomeie a receita. Acesse e selecione a guia modelo. No canto superior direito, arraste e solte o modelo de medição previamente criado na janela de medição.

Clique em sim para continuar na janela da receita de medição, selecione os mapeamentos de canal. Em seguida, selecione os mapeamentos de máscara de célula inteira. Depois, selecione a opção de célula inteira. Para máscara aprimorada, selecione a receita de medição na guia receita.

Na janela principal, selecione o ícone de salvar dentro da janela da receita de medição. Em seguida, feche a janela. Feche e reabra o campo de visão. Clique com o botão direito na pasta da lista de receitas e depois clique em nova, arrastando as receitas na ordem de aplicação necessária para dentro da lista de receitas, selecione bloquear lista de receitas e execute as receitas sequencialmente nos dados do vídeo usando o Adobe Photoshop.

Foi analisado a cada 20º quadro das mesmas colônias. Abra manualmente um quadro da imagem de uma colônia no Adobe Photoshop. Clique na ferramenta de varinha mágica na barra de ferramentas.

Clique na área ao redor da colônia para que todo o campo seja coberto, exceto a região da colônia. Certifique-se de que a linha pontilhada ao redor da colônia esteja ajustada exatamente ao redor da periferia da colônia e não no interior dela. Se a linha pontilhada não estiver ao redor da periferia, altere o valor de tolerância na barra de ferramentas superior conforme necessário.

Clique em editar no modo de máscara rápida na barra de ferramentas e clique na colônia para selecioná-la. Vá até a janela, abra o menu suspenso e clique em histograma. O cache deve ser definido como um.

Se o cache for dois, clique na marca de expressão de exclamação para alterar o cache para um. Registre o valor do pixel em uma planilha. Repita o processo acima para cada quadro de número 20.

Os dados coletados usando o Photoshop e o software CL quant podem então ser plotados em conjunto. Nosso protocolo para quantificação do crescimento de colônias de Células-Tronco Embrionárias Humanas demonstra uma aplicação da bioinformática de vídeo a um problema biológico. Aqui apresentamos um gráfico comparando o aumento no tamanho da colônia ao longo de 48 horas, conforme determinado usando o software CL quant e o Adobe Photoshop.

O gráfico mostra cinco colônias diferentes, cada uma analisada pelos dois pacotes de software. Cada colônia é representada por uma cor diferente. As linhas contínuas foram obtidas usando o software sail quant, enquanto as linhas tracejadas foram coletadas usando o Photoshop.

O gráfico dos dados brutos mostra que ambos os métodos de medição estão em bom acordo ao considerar o fato de que as colônias têm um tamanho inicial diferente. Esta figura mostra os dados replotados como o aumento percentual no tamanho da colônia. As taxas de crescimento são semelhantes independentemente do tamanho inicial da colônia, e ambas as medidas de análise fornecem resultados semelhantes.

O gráfico a seguir exibe as médias dos dados anteriores de variação percentual no crescimento de colônias de células-tronco embrionárias humanas. Este gráfico mostra claramente boa concordância entre a análise realizada utilizando bioinformática de vídeo e o Adobe Photoshop. Acabamos de mostrar como medir o crescimento de colônias de células-tronco embrionárias humanas usando ferramentas de bioinformática de vídeo.

Ao realizar este procedimento utilizando microscopia de contraste de fase, certifique-se de incluir o halo ao redor da colônia para uma seleção precisa da colônia pelo software. Também é importante lembrar que outros métodos de cultivo, incubação e coleta de vídeos podem ser utilizados em substituição ao protocolo que demonstramos. Uma vez que as receitas forem desenvolvidas e validadas, elas realizarão análises muito mais rapidamente e com menor variação experimental do que a análise manual.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.