Ensaio Metástase Experimental
24 de agosto de 2010
Este artigo descreve os procedimentos de um ensaio de metástase experimental que é usado para determinar o potencial metastático de linhagens de células humanas de câncer.
O objetivo geral do experimento a seguir é testar as capacidades metastáticas de células cancerígenas humanas por meio de injeções na veia caudal. Em camundongos imunodeficientes, as células são preparadas para injeção. Em seguida, as células são injetadas em camundongos imunodeficientes, que desenvolverão metástases pulmonares após um a dois meses.
Os camundongos são dissecados e as metástases pulmonares são quantificadas e cultivadas. Os resultados desse tipo de ensaio indicam o grau de metástase de um tipo específico de célula cancerígena. Olá, sou Sonali Mohanty do laboratório da Dra. LE, do Departamento de Genética Biomédica da Universidade de Rochester.
Hoje vamos mostrar um procedimento para realizar o ensaio de metástase experimental. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a metástase do câncer. Então, vamos começar.
Inicie com células cultivadas até cerca de 70% de confluência; aspire o meio do recipiente e lave suavemente uma vez com um XPBS. Em seguida, adicione dois mililitros de tripsina 0,05% inversando. Agite suavemente o recipiente para facilitar a dessanexação celular.
Observe as células ao microscópio enquanto elas se destacam. Adicione um volume generoso de meio contendo soro bovino fetal para inativar a tripsina. Em seguida, transfira para um tubo de 50 mililitros.
Conte as células utilizando um hemocitômetro. Uma vez determinada a concentração, centrifugue a aproximadamente 200 vezes a gravidade durante três minutos sem perturbar o pellet celular. Remova cuidadosamente o meio e ressuspenda em um volume apropriado de solução tampão equilibrada de Hank ou HBSS para atingir uma concentração final de cerca de cinco vezes 10 elevado a seis células por mililitro.
Em seguida, filtre através de um filtro celular de 70 micrômetros Falcon. Para excluir agregados celulares grandes, posicione a ponta da pipeta diretamente sobre o filtro, colocado sobre um tubo de cultura de cinco mililitros. Ejetar rapidamente a suspensão através do filtro para dentro do tubo.
Conte novamente as células usando tripano azul para determinar a viabilidade. A viabilidade deve ser maior que 90% antes da injeção. Em seguida, dilua até uma concentração final de 2,5 vezes 10⁶ células por mililitro.
Mantenha em gelo. Segure suavemente a cauda de um camundongo imunodeficiente e puxe-o para dentro do dispositivo de contenção, com as costas contra a fenda e a cauda saindo pela abertura traseira. Deslize lentamente o anel para dentro ao longo da fenda.
Uma vez que o anel prenda a boca do camundongo, fixe-o no lugar. O camundongo não deve ser capaz de se mover livremente, mas deve manter uma taxa normal de respiração. Localize as veias principais da cauda.
Quatro vasos sanguíneos principais estão presentes na cauda de um camundongo. As artérias estão localizadas nos lados dorsal e ventral da cauda. As veias estão localizadas nos lados laterais.
Aspire pelo menos 200 microlitros das células preparadas para dentro de uma seringa de um mililitro. Acople uma agulha fina de 30 graus e elimine todas as bolhas de ar. O volume final na seringa deve ser de 200 microlitros.
Prepare-se para injetar na extremidade distal da cauda. Assim, se a primeira tentativa falhar, uma região mais próxima da cauda poderá ser usada para uma segunda tentativa. Após limpar o local da injeção com etanol 70%, puxe a cauda para esticá-la.
Segure a ponta com o polegar e apoie a ponta para injeção com o indicador. Insira a agulha na veia e injete as células. Certifique-se de que a agulha e a seringa estejam paralelas à veia durante a injeção.
Caso contrário, a agulha perfurará a parede do vaso e as células serão injetadas nos tecidos adjacentes da cauda. Retire a agulha se o procedimento for bem-sucedido. O sangue deve perfundir a partir do local da injeção.
Pressione uma bola de algodão limpa para facilitar a passagem do fio dental e palpe a cauda para cima para empurrar qualquer amostra residual para a circulação. Solte o camundongo do dispositivo de contenção e devolva-o à gaiola. Registre o número de tentativas de injeção e o número de células injetadas em um caderno de laboratório.
Determine a viabilidade das células após a injeção. Como antes, esta etapa fornece a garantia de que as células permanecem vivas durante todo o processo de injeção. Ao final de um experimento de injeção, a viabilidade das células diminuirá, mas deve permanecer acima de 80%. Como etapa opcional, centrifugue as células remanescentes e lave os pellets com PBS uma vez.
Em seguida, congele os pellets a menos 80 graus Celsius para análises futuras, como western blotting. Para confirmar a expressão gênica após silenciamento, após um a dois meses, dissecar os camundongos para determinar os locais das metástases. Inicie colocando o camundongo eutanasiado em uma estação de dissecação.
Pulverize o camundongo abundantemente com etanol. Corte a caixa torácica para expor os pulmões e o coração. Em seguida, remova-os cuidadosamente e coloque-os em PBS.
O pulmão é o local primário para metástase, pois contém o primeiro leito capilar que as células encontram. Após entrarem na circulação, remova o coração e lave os pulmões em PBS, depois observe cada lobo do pulmão sob um microscópio estereoscópico. Conte o número de metástases detectáveis em ambos os lados do pulmão e some os números de metástases pulmonares nos quatro lobos para determinar o número total de metástases pulmonares.
Em seguida, isole metástases pulmonares individuais por excisão usando tesoura. Transfira cada metástase para um filtro celular de 70 micrômetros e pique-a usando a extremidade de uma tampa estéril de agulha. Enxágue o filtro celular com vários mililitros de meio e colete as células que passam através do filtro.
Em uma placa de cultura, cada placa contém células de uma metástase. Incube as células a 37 graus Celsius por pelo menos quatro dias sem perturbação. Inicialmente, tanto as células cancerígenas quanto as células fibroblásticas crescerão nas placas, mas gradualmente as células fibroblásticas desaparecerão e serão substituídas por células cancerígenas.
Se as células cancerígenas portarem genes resistentes a medicamentos, selecione as células com os antibióticos correspondentes. Após três dias, remova com lavagem qualquer sangue ou detritos teciduais, detritos no recipiente com PBS e adicione meio fresco. Avalie a pureza das células derivadas por imunomarcação com anticorpos contra proteínas específicas humanas aqui, sendo utilizado anticorpo anti-humano mesmo na ausência de seleção medicamentosa. Mais de 99% das células devem ser humanas.
As células recém-derivadas podem agora ser injetadas novamente em camundongos imunodeficientes para testar suas capacidades metastáticas ao final deste ensaio. Uma linhagem celular de câncer altamente metastática normalmente dá origem a muitas metástases pulmonares, enquanto muito poucas metástases pulmonares surgirão de uma linhagem celular de câncer pouco metastática. Essas imagens mostram metástases pulmonares dois meses após a injeção da linhagem celular de melanoma humano.
Um 3 7 5 sm. As células derivadas usando este método geralmente apresentam maior metástase do que a linhagem parental quando testadas. Novamente utilizando este ensaio, acabamos de mostrar a você o procedimento para realizar o ensaio de metástase experimental.
Ao realizar este procedimento, é muito importante lembrar-se de garantir que as células sejam injetadas na veia da cauda, e não no intestino ou no tecido da cauda. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo descreve um ensaio experimental de metástase utilizado para avaliar o potencial metastático de linhagens celulares de câncer humano por meio de injeções na veia caudal em camundongos imunodeficientes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Oncologia
- Pesquisa em Metástase
- Biologia Experimental
Antecedentes
- Compreender a metástase do câncer é fundamental para desenvolver tratamentos eficazes.
- Ensaios experimentais ajudam a quantificar o potencial metastático de células cancerígenas.
- Camundongos imunodeficientes fornecem um modelo adequado para estudar o comportamento de células humanas do câncer.
- Injeções na veia caudal são um método comum para avaliar metástases pulmonares.
Objetivo do Estudo
- Testar as capacidades metastáticas de células cancerígenas humanas.
- Quantificar e cultivar metástases pulmonares geradas a partir de células injetadas.
- Fornecer informações sobre o potencial metastático de diferentes linhagens de células cancerígenas.
Métodos Utilizados
- Preparação de células cancerígenas humanas para injeção.
- Injeção de células na veia caudal de camundongos imunodeficientes.
- Monitoramento do desenvolvimento de metástases pulmonares ao longo de um a dois meses.
- Dissecação de camundongos para quantificação e cultivo de metástases pulmonares.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de metástases pulmonares a partir de células cancerígenas injetadas.
- A quantificação das metástases fornece dados sobre o potencial metastático.
- As metástases cultivadas podem ser utilizadas para análises adicionais.
- Os resultados indicam variabilidade nas capacidades metastáticas entre diferentes linhagens celulares de câncer.
Conclusões
- O ensaio de metástase experimental é eficaz para avaliar o comportamento das células cancerígenas.
- Os conhecimentos obtidos podem orientar estratégias terapêuticas contra o câncer metastático.
- Estudos futuros podem se basear nestes achados para explorar os mecanismos subjacentes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O ensaio de metástase experimental fornece um modelo quantitativo in vivo para avaliar o potencial metastático de linhagens celulares de câncer humano, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos oncológicos. Ao permitir o isolamento e a propagação de derivados altamente metastáticos, o ensaio facilita a identificação de genes e vias que regulam a progressão metastática, informando assim a identificação de compostos líderes e a priorização pré-clínica. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva no desenvolvimento terapêutico subsequente, ao vincular achados in vitro a desfechos funcionais de metástase em um sistema relevante para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação da capacidade metastática de células cancerígenas após perturbação genética ou farmacológica.
- Valor Operacional: Fornece uma leitura funcional reprodutível in vivo para a validação de alvos em vias relevantes para metástase.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação mecanicista ao associar alterações moleculares a fenótipos metastáticos em camundongos imunocomprometidos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera contagens quantitativas de metástases que servem como variáveis dependentes para triagem de moduladores da disseminação metastática.
- Valor Operacional: Padroniza os procedimentos de preparação celular, injeção e coleta de tecidos para garantir a reprodutibilidade entre experimentos.
- Valor Científico: Permite a obtenção de linhagens celulares metastáticas com propriedades invasivas aumentadas para uso em triagem secundária e desvendamento de alvos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Utiliza um sistema relevante para a doença em que a formação de metástases pulmonares espelha os padrões clínicos de disseminação hematogênica.
- Valor Operacional: Permite estudos longitudinais ao possibilitar a reinjeção de metástases cultivadas para avaliar a estabilidade do fenótipo metastático.
- Valor Científico: Facilita a descoberta de biomarcadores ao permitir o perfil molecular de metástases isoladas em comparação com linhagens parentais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio atua como uma ferramenta na fase de descoberta que conecta a testagem de hipóteses sobre alvos com a validação fenotípica, orientando decisões sobre a progressão de compostos e acompanhamento mecanicista em pipelines oncológicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a investigação orientada por hipóteses de reguladores da metástase por meio de ensaios quantitativos de colonização pulmonar.
- Triagem: Fornece resultados padronizados e quantificáveis (número de metástases por pulmão), permitindo comparações entre condições genéticas ou químicas.
- Análises: Gera dados baseados em contagens, adequados para análise estatística, com o objetivo de determinar diferenças significativas no potencial metastático.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta inicial à validação pré-clínica, fornecendo um modelo que reflete o tropismo metastático específico por órgão.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliação da capacidade metastática em diversos tipos de câncer e modalidades terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na seleção de alvos ao demonstrar vínculos causais entre a modulação gênica e a supressão ou potencialização da metástase.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de limiares padronizados de viabilidade celular (>90% antes da injeção, >80% após a injeção) e volumes padronizados de injeção.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não ao fornecer dados funcionais de metástase que complementam ensaios de invasão e proliferação in vitro.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em seus efeitos demonstrados sobre a carga metastática in vivo.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em manipulação de animais, técnicas de injeção intravenosa e dissecção asséptica de tecidos.
- Depende do acesso a modelos de camundongos imunodeficientes e instalações para hospedagem animal de longo prazo (um a dois meses).
- Necessita de protocolos padronizados para preparação celular, avaliação de viabilidade e quantificação de metástases para minimizar a variabilidade.
- Envolve considerações técnicas para o isolamento de metástases, incluindo dissociação enzimática ou mecânica e filtração para obter culturas de células isoladas.
- Limita-se à modelagem da disseminação inicial e colonização pulmonar; não abrange estágios posteriores da metástase, como extravasamento ou crescimento em órgãos distantes além do pulmão.
