Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin

Olá, meu nome é Rick Pasqua, aluno do Laboratório de Engenharia de Células-Tronco do Departamento de Ciências Químicas e da Vida da Universidade Estadual da Virgínia. Neste vídeo, demonstrarei como nosso laboratório utiliza um aparelho de centrifugação STO de baixo custo e fabricado internamente para criar uma monocamada observável de células-tronco pluripotentes humanas, a fim de quantificar marcadores de superfície celular. Como muitos protocolos IMUNOQUÍMICOS são adaptados para hPSCs cultivadas em lâminas com câmara em forma de colônias, podem surgir problemas na caracterização da expressão dos biomarcadores ao nível celular individual.

Ter as células em uma monocamada auxilia não apenas na análise visual destas, mas possivelmente também na quantificação de sua expressão; o aparelho de espalhamento celular utilizado em nossos laboratórios pode ser construído com materiais encontrados na maioria dos laboratórios, necessita apenas de uma pequena amostra de células e não requer nenhum tipo de reagente específico. E, mais importante, é capaz de reproduzir de forma confiável uma dispersão de células isoladas para observação. Abaixo estão algumas das coisas necessárias para montar o aparelho de citosina.

Lâminas de plástico, já que estas não precisam necessariamente ser limpas, você pode usar lâminas de câmara antigas, se desejar. Lâminas de vidro pré-limpas. Estas precisam ser limpas porque será aí que a monocamada celular será criada.

Papel filtro, qualquer tipo serve, e ponteiras para micropipeta. Ponteiras de 1 a 10 microlitros são as utilizadas em nosso laboratório antes de iniciar a montagem. Primeiramente, devem ser feitos furos nas lâminas de plástico.

Isso pode ser feito usando uma furadeira de bancada. O diâmetro dos orifícios depende do tamanho da ponteira de micropipeta e deve ser aproximadamente igual à largura da seção mais larga da ponteira utilizada para uma micropipeta padrão de um a dez microlitros. Isso deve ser em torno de sete milímetros.

A quantidade de orifícios que você cria nos lâminas de plástico depende totalmente do uso pretendido. Para a coloração imunoquímica em nosso laboratório, por exemplo, geralmente usamos dois orifícios, um para a coloração positiva e outro para o controle negativo do fundo. Esses lâminas podem ser reutilizados por uma quantidade indefinida de vezes.

Para o papel de filtro, basta recortar um pedaço com as dimensões do lâmina de plástico. Utilize os orifícios da lâmina como referência para fazer orifícios no papel de filtro. O tamanho do orifício no papel de filtro deve ser grande o suficiente para que a ponteira de micropipeta se encaixe firmemente, como mostrado aqui.

Em seguida, precisamos recortar o número apropriado de ponteiras de micropipeta, uma para cada orifício, com cerca de metade do seu comprimento. Isso servirá como base da lâmina de vidro onde será criada a monocamada celular. Em seguida, o papel filtro será colocado sobre esta base.

O papel-filtro servirá para absorver qualquer meio em excesso da coloração por suspensão. Em seguida, será coberto com uma lâmina de plástico que funcionará como suporte sólido do aparato. Em seguida, pode ser selado em todos os quatro lados com fita adesiva comum.

Por fim, ponteiras inteiras de micropipeta são inseridas nas pontas cortadas do aparelho. Esse será o local onde as amostras celulares, após a coloração em suspensão, serão colocadas. Pode ser útil marcar inicialmente a posição das pontas cortadas na lâmina de vidro para facilitar o reconhecimento.

O protocolo de coloração em suspensão imunoquímica utilizado em nosso laboratório envolve primeiro a coleta de células-tronco em uma suspensão de células isoladas, geralmente realizada por dissociação enzimática, utilizando tripsina ou tampões de dissociação celular à base de EDTA não enzimáticos. As células são então transferidas para tubos microcentrífugos de um ml ou dois ml com seu meio de crescimento padrão. Em seguida, são centrifugadas a 200 Gs por quatro minutos.

A mesma velocidade de centrifugação será usada em todas as etapas subsequentes de lavagem e centrifugação. Em seguida, o meio é aspirado manualmente; tenha cuidado extra durante a aspiração para garantir que o pellet celular permaneça inalterado. Em seguida, realiza-se a lavagem com um ml de PBS duas vezes, centrifugando e aspirando após cada etapa.

O próximo passo envolve a fixação das células utilizando reagentes de formaldeído a 4% ou PFA necessários para isso ou listados no texto explicativo acompanhante deste vídeo. As células são incubadas na solução de formaldeído a 4% e deixadas à temperatura ambiente por 10 minutos. Recomenda-se que este passo seja realizado antes da suspensão extracelular, coloração para o uso do aparelho citocentrifugador.

Posteriormente, as células são lavadas duas vezes com PBS para remover traços de PFA. As células devem então ser bloqueadas para evitar coloração inespecífica. Após as lavagens com PBS na etapa anterior, aspire o líquido de lavagem e adicione um mL da solução de bloqueio.

Isso deve então ser deixado em temperatura ambiente por cerca de 45 minutos. Enquanto espera a solução de bloqueio, você pode preparar o anticorpo primário diluindo-o na diluição recomendada e na solução de bloqueio. Armazene isso a quatro graus Celsius.

Após as células terem permanecido na solução bloqueadora por cerca de 45 minutos, centrifugue e aspire a solução, depois ressuspenda-as na solução de anticorpo primário. Para fins de detecção de ligação inespecífica e controle de fundo, é recomendável manter pelo menos uma amostra como negativa, à qual não é adicionado anticorpo primário e que é simplesmente ressuspendida em PBS.

Todas as amostras são deixadas em temperatura ambiente por aproximadamente uma hora. Se desejado, as células fixadas podem ser deixadas em suspensão na solução de anticorpo primário durante a noite e lavadas duas vezes com solução bloqueadora. A solução de anticorpo secundário pode ser preparada enquanto as lavagens são realizadas.

Os anticorpos secundários são geralmente sensíveis à luz, portanto, sempre que possível, reduza a iluminação do laboratório e cubra os recipientes utilizados com papel alumínio, a fim de evitar o desbotamento da fluorescência. Reagentes antifa podem ser incorporados ao protocolo, mas deve-se ter cuidado em seu uso, pois podem resultar em um fundo mais alto, assim como o anticorpo primário diluído na concentração recomendada na solução bloqueadora. Aplique uma vis a todas as amostras, independentemente de ter sido adicionado ou não o anticorpo primário, após a conclusão da lavagem.

Deixe repousar em uma área escura, como dentro de um frasco, por cerca de uma hora. Lave as células duas vezes com um ml de solução bloqueadora. As células devem estar prontas para a coloração nuclear com o corante DPI.

Prepare a solução de DPI inicialmente em uma diluição de um para 10.000 em PBS, lave as células uma vez com um ml de PBS, depois ressuspenda em DPI e deixe em repouso à temperatura ambiente por cerca de cinco a 10 minutos. Assim como o anticorpo secundário, o DAPI é sensível à luz, portanto faça os ajustes necessários para evitar o desbotamento da fluorescência. Lave uma vez com um ml de PBS e, finalmente, ressuspenda.

Suspender novamente em um mL de PBS. Isso deverá deixá-lo pronto para uso com um aparelho de citocentrifugação. Colocar no máximo 100 microlitros da solução de células isoladas na extremidade superior das ponteiras de micropipeta.

Recomenda-se, no entanto, uma quantidade menor para evitar transbordamento ou gotejamento desnecessários. Em seguida, posicione um aparelho de citocentrifugação e o contrapeso em uma centrífuga de bancada e centrifugue a 1000 RPM durante quatro minutos. Após isso, desmonte cuidadosamente o aparelho de citocentrifugação de forma a minimizar a possibilidade de desprendimento das células da lâmina de vidro.

Verifique se a sedimentação ocorreu sob microscópio de fluorescência antes do acondicionamento. Estas são imagens de uma monocamada de células BG one V coradas com quatro marcadores de superfície celular SSCA provenientes do aparelho citocentrifugador. Observe como as células estão isoladas umas das outras, permitindo observações e registros em nível de célula única.

O que há de bom neste protocolo é que ele é capaz de reproduzir uma monocamada de células viável, economicamente eficaz e facilmente adaptável para qualquer análise de rotina de culturas de células-tronco. Com isso, espero que você aproveite este vídeo e encontre no protocolo uma utilidade para a sua própria pesquisa.