Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome
15 de junho de 2010
Este artigo descreve um protocolo para a extração de traduzir os ribossomos das células eucarióticas. Uma vez extraído, ribossomos são separados em monosomes e polirribossomos por fracionamento gradiente de sacarose para permitir diferentes populações ribossomal a ser analisado. Como tal, este método é o padrão ouro para examinar a regulamentação da tradução.
O objetivo geral deste procedimento é separar e comparar as frações de monozona e polirribossomos provenientes de lisados celulares. Isso é realizado primeiramente cultivando as células de interesse. O segundo passo do procedimento é preparar o lisado celular.
O terceiro passo do procedimento é centrifugar o lisado através de um gradiente de sacarose. O passo final do procedimento é fracionar o gradiente e visualizar as diferentes populações ribossomais por meio de um traçado de UV. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram alterações na tradução sob diferentes condições experimentais por meio da análise do perfil de polirribossomos.
Olá, sou Anthony Esposito do laboratório da Dra. Terry Goss Kinsey do departamento de Genética Molecular, Microbiologia e Imunologia na UMD e na Escola de Medicina J Robert Wood Johnson. E eu sou Marcus Lewis, também do Laboratório McKinsey aqui na RWJMS.
Hoje vamos mostrar um procedimento para análise de polirribossomos. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar alterações na síntese de proteínas que surgem de mutações ou fatores ambientais. Então, vamos começar. Sacarose.
Os gradientes devem ser preparados um dia antes do uso para permitir que se tornem contínuos. Misture os volumes apropriados das soluções estoque de sacarose a 7% e 47% para obter 48 mililitros de cada uma das seguintes concentrações de sacarose: 7%, 17%, 27%, 37% e 47%. Adicione DTT 1 M a cada solução de sacarose até uma concentração final de 1 milimolar. Para despejar os gradientes, acople uma pipeta de pasta a uma seringa de 20 mililitros, fixando e selando com filme parafilm.
Adicione sete mililitros de sacarose a 7% na parte inferior de um tubo de ultracentrífuga de poliamida de uma polegada por 3,5 polegadas. Em seguida, adicione sete mililitros de solução de sacarose a 17% abaixo da solução a 7%, colocando a ponta da pipeta Pasteur próximo ao fundo do tubo e pipetando lentamente. Deve-se levar não menos de 20 segundos para despejar cada camada.
Repita com sete mililitros de soluções de sacarose a 27%, 37% e 47% quando o gradiente tiver sido formado. Você deverá observar linhas nítidas entre as camadas, indicando que ocorreu mistura mínima. Armazene todos os gradientes a quatro graus Celsius durante a noite, juntamente com os rotores, frascos e tubos que serão utilizados para colher as amostras.
Para preparar extratos de células de levedura, comece cultivando centenas de 25 mililitros de cultura de levedura até uma OD 600 de 0,8 a 1,0. Adicione ciclo-heximida à cultura até uma concentração final de 100 microgramas por mililitro e continue agitando a 30 graus Celsius por 15 minutos. Após 15 minutos, despeje a cultura em um frasco de centrífuga de 250 mililitros e preencha com gelo.
Mantenha tudo em gelo a partir deste ponto; centrifugue a 8.000 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Resuspenda o pellet em 10 mililitros de tampão de lise gelado e transfira para tubos de polipropileno de 15 mililitros. Centrifugue a 5.900 × g durante três minutos a quatro graus Celsius. Resuspenda.
Suspenda o pellet em 0,5 mililitros de tampão de lise. Transfira a suspensão para um tubo microfuga de 1,5 mililitro e adicione então 0,5 mililitros de esferas de vidro acidificadas e aquecidas previamente. Vortexe as células por quatro intervalos de 30 segundos, resfriando o tubo em gelo por 30 segundos entre cada intervalo.
Em seguida, adicione mais 0,5 mililitros de tampão de lise ao tubo de 1,5 mililitro e centrifugue a 5.000 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e centrifugue na velocidade máxima durante 10 minutos a quatro graus Celsius.
Por fim, transfira o sobrenadante para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. O extrato pode ser armazenado a menos 80 graus Celsius para transferir o lisado para o gradiente de sacarose. Coloque a ponta da pipeta contra a parede do tubo próximo à superfície do gradiente e sobreponha suavemente o lisado sobre o gradiente.
Para um gradiente de 35 mililitros, geralmente são carregados 500 microlitros de lisado. Usando pinças, abaixe cuidadosamente o gradiente no compartimento de um rotor de rotor oscilante. Centrifugue os gradientes a 100.000 ×g por quatro horas a quatro graus Celsius.
Aproximadamente 30 minutos antes da conclusão da centrifugação de quatro horas. Conecte a agulha ao perfurador do tubo e conecte a caneta ao monitor online de absorbância e fluorescência. Ligue a alimentação do monitor de absorbância para permitir que uma linha de base estável seja alcançada antes da análise das amostras.
A aquisição eletrônica do perfil PolyZone pode ser facilmente obtida em tempo real conectando uma unidade de aquisição de dados DI 1 48 U. Ao gravador de gráficos, encha a bomba de seringa com 50 mililitros de florin nuts usando a configuração rápida de fluxo reverso. Certifique-se de que não haja bolhas de ar presentes.
Conecte a mangueira da seringa ao perfurador de tubos. E ligue brevemente o fluxo de Flo inerte na direção direta a seis mililitros por minuto. Para remover bolhas de ar da mangueira, coloque uma série de tubos sob a mangueira na extremidade da célula de fluxo para coletar o escoamento da amostra.
Prepare um balde de gelo com um orifício pré-formado para acomodar o tubo de centrífuga contendo o gradiente de sacarose. Quando a centrifugação de quatro horas estiver concluída, remova cuidadosamente os tubos de centrífuga do rotor da centrífuga e coloque-os sobre gelo, tomando cuidado para não perturbar os gradientes.
Para analisar extratos celulares, coloque o tubo de gradiente no furador de tubos e conecte a parte superior do tubo à saída e fixe. Eleve o estágio inferior até o tubo de centrífuga para que a agulha perfure a base do tubo. Inicie o fluxo de Florin alert no sentido direto a seis mililitros por minuto.
Uma vez que o fluxo tenha começado a entrar no tubo, monitore o movimento da agulha no monitor online de absorbância UV. Quando a agulha começar a se mover, ligue o movimento do gráfico para uma velocidade de 60. Quando o final do perfil de polirribossomo for alcançado, desligue o fluxo de Flo inert para o tubo de centrífuga e pare o movimento do gráfico no monitor de absorbância e fluorescência.
Retire o Flo inerte do tubo de centrífuga para dentro da seringa iniciando o fluxo em direção reversa em uma taxa rápida, tomando cuidado para não aspirar a sacarose do tubo para dentro da seringa. Desrosqueie o tubo de centrífuga do perfurador de tubos, abaixe a agulha e remova o tubo. Um traçado representativo de um extrato de ribossomos preparado a partir de levedura na presença de ciclo-heptano é mostrado aqui.
Os picos de absorvância UV contendo polirribossomos e ribossomos A TS 60 s e 40 s são indicados. Acabamos de mostrar como realizar a análise de polirribossomos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de trabalhar rapidamente, mantendo as amostras frias e os RNAs livres de degradação.
É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte em seus experimentos.
Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para extrair ribossomos em tradução de células eucarióticas, permitindo a análise de diferentes populações ribossomais. O método envolve a separação de ribossomos em monossomos e polirribossomos por meio da fracionamento em gradiente de sacarose, essencial para o estudo da regulação da tradução.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Genética
Antecedentes
- Compreender a função do ribossomo é essencial para estudar a síntese de proteínas.
- O perfilhamento de polirribossomos fornece informações sobre a regulação da tradução.
- As técnicas de extração de ribossomos são fundamentais na pesquisa em biologia molecular.
- Fatores ambientais e mutações podem alterar a síntese de proteínas.
Objetivo do Estudo
- Separar e comparar frações de monorribossomos e politribossomos de lisados celulares.
- Visualizar diferentes populações ribossomais por meio de rastreamento com UV.
- Analisar alterações na tradução sob diversas condições experimentais.
Métodos Utilizados
- Cultivo de células eucarióticas e preparação de lisados celulares.
- Centrifugação através de um gradiente de sacarose.
- Fractionamento do gradiente para isolar populações ribossomais.
- Visualização de perfis ribossomais utilizando monitoramento da absorção de UV.
Resultados Principais
- Separação bem-sucedida de monossomos e politribossomos.
- Visualização clara das populações ribossomais por meio de rastreamento com UV.
- Análise da regulação da tradução sob diferentes condições.
- Informações sobre o impacto de mutações na síntese proteica.
Conclusões
- O protocolo é um padrão ouro para o estudo da regulação da tradução.
- Ele permite aos pesquisadores analisar de forma eficaz a dinâmica ribossomal.
- Os achados contribuem para a compreensão dos mecanismos moleculares da tradução.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise de perfil de polirribossomos permite que equipes de biofármacos investiguem mecanismos de controle da tradução e detectem defeitos na síntese proteica em pontos críticos de descoberta. Este método fornece informações quantitativas sobre a tradução global e específica por transcrito, apoiando a confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas. Sua adaptabilidade a diversos sistemas eucarióticos garante relevância ampla para portfólios de pesquisa básica e translacional em estágios iniciais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a avaliação direta da regulação traducional sob perturbações genéticas ou ambientais.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao distinguir defeitos na iniciação versus alongamento/terminação.
- Facilita a validação funcional de alvos ao quantificar alterações nas razões polirribossomo-mônossomo.
- Oferece uma plataforma para avaliar o impacto de intervenções candidatas na síntese proteica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece leituras quantitativas validadas do engajamento ribossomal para padronização de ensaios.
- Permite a fracionamento reprodutível e detecção baseada em UV de populações ribossomais.
- Prepara extratos biológicos adequados para fluxos de trabalho de análise de mRNA ou proteínas em etapas subsequentes.
- Permite a triagem de compostos que modulam a maquinaria de tradução ou vias regulatórias.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a descoberta de biomarcadores tradutivos com insights mecanicistas sobre a regulação da síntese proteica.
- Garante a continuidade de modelos celulares a sistemas pré-clínicos, adaptando protocolos entre espécies eucarióticas.
- Informa decisões de avanço com ajuste de risco ao revelar defeitos tradutivos associados a modelos de doenças.
- Fornece contexto mecanicista para fenótipos observados em estudos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O perfilamento de polirribossomos integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a investigação orientada por hipóteses da tradução, apoiando tanto a validação de alvos quanto a identificação de compostos promissores.
- Biologia da Descoberta: Quantifica a produção traducional e esclarece mecanismos regulatórios específicos de vias.
- Triagem: Oferece fracionamento robusto e quantitativo e saídas de absorbância UV prontas para ensaios.
- Análises: Fornece medição quantitativa em tempo real de populações ribossomais para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta modelos celulares e pré-clínicos ao permitir adaptação de protocolos e alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável para diversos estudos translacionais e mecanicistas em diferentes programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de controle traducional.
- Valor Operacional: Padroniza os fluxos de trabalho de extração, fracionamento e detecção para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção ao revelar gargalos traducionais e apoiar a triagem eficiente de portfólios em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e modelos com base na fidelidade traducional.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em biologia de ribossomos e técnicas de fracionamento em gradiente.
- Exige acesso a ultracentrifugação e instrumentação de absorbância UV.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes para resultados reprodutíveis.
- Adaptável a sistemas de levedura e mamíferos com modificações no protocolo conforme necessário.
- A integridade da amostra e condições livres de RNase são essenciais para resultados confiáveis.
