Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial
19 de maio de 2010
Descrevemos uma molécula baseada em pequenas protocolo para a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos em células precursoras de oligodendrócitos (OPCs). Este protocolo gera Olig2 + + NG2 OPCs com alta eficiência por 30 dias de diferenciação. Nós também descrevem um método para gerar "spiking" OPCs que pode disparar potenciais de ação.
O objetivo geral do experimento a seguir é gerar precursores de oligodendrócitos a partir de células-tronco embrionárias por meio de uma série de etapas de cultivo ao longo de 30 dias. Isso é alcançado inicialmente pela formação de corpos embrionários a partir de células ES de camundongo para iniciar a diferenciação celular. Como segundo passo, os corpos embrionários são tratados com as moléculas pequenas ácido retinóico e morfina pura, que induzem a diferenciação direcionada das células em uma liga den.
Precursores de citos. Como terceira etapa, os corpos embrionários são dissociados em células individuais após mais 22 dias. Em cultura, aproximadamente 80% das células são OPCs.
Em seguida, os OPCs derivados de MESC são transduzidos com vírus bao que carreiam a subunidade NAV 1.2 para gerar OPCs geradores de potenciais de ação. Os resultados obtidos demonstram a expressão do marcador de OPC e as propriedades de geração de potenciais de ação desses OPCs derivados de MESC, com base em microscopia de imunofluorescência e gravações eletrofisiológicas. Olá, sou Pong Chiang do laboratório da Dra. Ing, do Departamento de Biologia Celular e Anatomia Humana da Universidade da Califórnia em Davis. Também estamos vinculados ao Hospital Shriners para Crianças do Norte da Califórnia.
Olá, sou Vial Raj, também do laboratório Deng. Hoje vamos mostrar um procedimento para a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongo em células precursoras de oligodendrócitos. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar as propriedades de precursores de oligodendrócitos derivados de células-tronco embrionárias, com o objetivo de gerar células com maior potencial terapêutico.
Então vamos começar. Hoje, células precursoras de oligodendrócitos ou OPCs serão geradas a partir da linhagem de células-tronco embrionárias de camundongo OG2 GFP. Essas células-tronco embrionárias precisam ser repassadas a cada três dias para mantê-las saudáveis em uma densidade ideal e para evitar diferenciação espontânea. Repasse.
Células ESS quando estão com 70% de confluência sob uma capela de fluxo laminar. Remova o meio sobre a cultura. Lave com PBS e adicione tripsina aos olhos com dois mililitros de pré-aquecimento.
Uma passagem em LE expresso por cinco minutos a 37 graus Celsius. Interrompa a reação e resuspenda as células em quatro mililitros de meio celular MES. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros e pelote-as a 1000 RP por cinco minutos.
Resuspenda em meio de placa MESL, um décimo das células sobre uma camada de fibroblastos irradiados com metionina em meio para células MES. Após três dias, as células ES estão aproximadamente 70% confluentes e estão prontas para serem repassadas ou suspensas para formar corpos embrionários, induzindo assim a formação de corpos embrionários e iniciando a diferenciação. Tripsinize as colônias de células ES de camundongo como antes e, em seguida, resuspenda as células em meio com substituto de soro knockout ou meio KSR. Conte as células em um hemo TER, dilua a suspensão em KSR.
Médio até 15.000 células por mililitro, plaque três mililitros em cada poço de uma placa de cultura ultrabaixa adesão com seis poços. Incube as células suspensas a 37 graus Celsius por quatro dias. Troque o meio completamente a cada dois dias.
A partir do quarto dia, substitua o meio diariamente no quarto dia. Suplemente o KSR com 0,2 micromolar de ácido retinóico no quinto dia e com ácido retinóico e um micromolar de primor famine nos sexto e sétimo dias. Alimente os corpos embrionários com dois meios, suplementados com 0,2 micromolar de ácido retinóico e um micromolar de primor famine. Após oito dias em cultura, a maioria dos corpos embrionários expressa GFP e está pronta para ser dissociada com tripsina, e as células devem ser contadas como anteriormente.
Em seguida, reconstitua-os a 3,5 × 10⁵ células por mililitro. Em meio OPC, reconstitua três mililitros da suspensão em meio OPC. Usando placas de 60 milímetros revestidas com poliornitina, aproximadamente a cada semana, as células ficarão confluente e terão esta aparência; passe as células como antes, com uma tripsinização de três minutos.
30 dias após a suspensão inicial de ressus. Em meio KSR, as células apresentam características de células precursoras de oligodendrócitos para gerar OPCs com despolarização. Utilize OPCs derivadas de ESL de camundongo que estejam entre 50 e 70% confluentes.
Troque o meio por um XPBS para lavar as células. Para introduzir o canal de sódio sensível à voltagem. Subunidade alfa 1.2.
Utilizamos o kit do canal de sódio back MAM. Misture um mililitro do componente A do back MAM com quatro mililitros de um XPBS. Remova a lavagem com PBS e adicione o componente diluído.
Incubar a 37 graus Celsius por duas horas. Substitua o agente de repouso pela média OPC enriquecida com os componentes B e C conforme descrito no kit. Instruções: incubar por mais duas horas a 37 graus Celsius.
Após a incubação, substitua o meio enriquecido por meio OPC fresco. Após mais 24 horas de cultivo, os OPCs derivados de ESL podem ser analisados quanto à atividade de disparo neste ponto temporal. Os EBS não apresentam qualquer fluorescência GFP.
Os EBS apresentam forte expressão de GFP e estão prontos para o cultivo por desagregação cerca de 30 dias após a suspensão inicial de ressus. No meio KSR, a maioria das células é imunopositiva para a coloração NG2, o que é consistente com a expressão de GFP. No entanto, ao contrário dos OPCs cerebrais, esses OPCs derivados de células MES não geram potenciais de ação, mesmo quando as células são despolarizadas até zero milivolts.
Após a introdução da subunidade NAV 1.2 por transdução viral, essas CPO derivadas de células MES ficam excitadas e disparam potenciais de ação. Acabamos de mostrar como diferenciar células-tronco embrionárias de camundongo em CPOs e gerar CPOs com despolarização por meio de transdução viral. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de armazenar adequadamente o ácido retinóico, a morfina e o FGF dois e sempre usar alíquotas frescas, descartando qualquer excesso de ácido retinóico após o uso.
Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongo em células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) utilizando moléculas pequenas. O método alcança alta eficiência na geração de OPCs Olig2+NG2+ em 30 dias e inclui uma técnica para produzir OPCs despolarizantes, capazes de gerar potenciais de ação.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa com Células-Tronco
Contexto
- As células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) são fundamentais para a mielinização no sistema nervoso central.
- As células-tronco embrionárias de camundongo (células ES) podem ser diferenciadas em OPCs para fins de pesquisa e terapêuticos.
- Moléculas pequenas podem direcionar eficazmente o processo de diferenciação.
- Compreender as propriedades das OPCs pode aumentar o potencial terapêutico em distúrbios neurológicos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável para gerar OPCs a partir de células ES de camundongo.
- Investigar as propriedades eletrofisiológicas de OPCs diferenciadas.
- Explorar o potencial de OPCs despolarizantes em aplicações terapêuticas.
Métodos Utilizados
- Corpos embrionários são formados a partir de células ES de camundongo para iniciar a diferenciação.
- Moléculas pequenas, incluindo ácido retinóico e morfina pura, são utilizadas para induzir a diferenciação.
- As células são dissociadas e cultivadas para enriquecer a população de OPCs.
- A transdução viral é empregada para introduzir canais de sódio dependentes de voltagem nos OPCs.
Resultados Principais
- Aproximadamente 80% das células cultivadas são identificadas como OPCs após 30 dias.
- A microscopia de imunofluorescência confirma a expressão de marcadores de OPCs.
- Registros eletrofisiológicos demonstram as propriedades de disparo dos OPCs transduzidos.
- OPCs não transduzidos não exibem potenciais de ação, destacando a eficácia do método de transdução viral.
Conclusões
- O protocolo gera efetivamente OPCs a partir de células-tronco embrionárias de camundongo.
- A transdução viral converte com sucesso OPCs em células geradoras de potenciais de ação.
- Este método fornece uma base para o estudo de OPCs no contexto da pesquisa e terapia neurológicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias em células precursoras de oligodendrócitos (CPOs) atende a uma necessidade crítica por fontes celulares escalonáveis e comprometidas com a linhagem na pesquisa regenerativa do SNC. Este protocolo permite a geração em alta produtividade de CPOs fenotipicamente definidas, sustentando confiança preditiva na validação inicial de alvos e em estudos funcionais. A abordagem facilita a desvinculação mecanicista e a triagem de portfólios para estratégias terapêuticas baseadas em células direcionadas a doenças desmielinizantes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação do comprometimento da linhagem oligodendrocítica e da especificidade de vias utilizando marcadores moleculares definidos.
- Apoia a desmistificação biológica ao gerar OPCs com perfis de expressão consistentes de Olig2 e NG2.
- Facilita a confiança preditiva na validação funcional de alvos por meio da caracterização eletrofisiológica de subpopulações de OPCs.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece uma fonte reproduzível de OPCs validadas para triagem de compostos e ensaios fenotípicos subsequentes.
- Padroniza os resultados da diferenciação, garantindo o desenvolvimento de ensaios quantitativos e escalonáveis.
- Permite a avaliação confiável de moléculas candidatas em sistemas da linhagem de oligodendrócitos relevantes para doenças.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos de OPC in vitro com fenótipos derivados de tecido primário para continuidade translacional.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, permitindo estudos funcionais em OPCs com disparo e sem disparo.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas para candidatos na linha de terapia celular direcionados à desmielinização.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de diferenciação se integra ao continuum de descoberta até a pré-clínica, permitindo a validação precoce de alvos, o desenvolvimento de ensaios e pesquisas translacionais sobre a biologia de OPCs.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre o comprometimento de linhagem e as propriedades funcionais de OPCs.
- Triagem: Fornece populações padronizadas e reprodutíveis de OPCs para plataformas de ensaio quantitativo.
- Análises: Oferece leituras de imunofluorescência e eletrofisiológicas para análise comparativa de subtipos de OPCs.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro com modelos de tecido primário para alinhamento pré-clínico.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho reutilizável para geração de OPCs em múltiplos programas de pesquisa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em pesquisas focadas em OPCs.
- Valor Operacional: Fornece geração padronizada, escalável e reprodutível de OPCs para fluxos de trabalho entre equipes.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de prosseguir ou interromper projetos e a eficiência no uso de capital em portfólios de terapia celular e neuroregeneração.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos terapêuticos baseados em OPCs.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em cultura de células-tronco, diferenciação e técnicas de transdução viral.
- Requer acesso à infraestrutura de microscopia de imunofluorescência e registro eletrofisiológico.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes dos protocolos de diferenciação e ensaios.
- Pode exigir adaptação para diferentes linhagens de células-tronco embrionárias ou modelos específicos de espécies.
- Depende da qualidade consistente dos reagentes e do tempo preciso das etapas de diferenciação.
