Electrosoldável célula visualizado com microscopia de fluorescência
1 de julho de 2010
Neste vídeo demonstramos eletrofusão eficiente de células In vitro Por meio do método de adesão modificados utilizando eletroporação ea detecção posterior de visualização células fundidas com microscopia de fluorescência.
A eletrofusão envolve a aplicação de pulsos elétricos curtos e de alta voltagem em células em contato próximo. Neste vídeo, demonstramos a eletrofusão de células in vitro por meio do Método de Adesão modificado. Os experimentos foram realizados com células de melanoma de camundongo, BF um.
Para o experimento, siga estes passos. Cultive células em dois frascos de cultura separados até atingirem 80% de confluência. Separadamente, adicione 2,1 microlitros de cada solução estoque.
10 milimolar de C-M-F-D-A ou CMRA, respectivamente, em três mililitros de tampão Krebs Hess em um tubo de centrífuga. Lave as células duas vezes com tampão Krebs Hess e, em seguida, adicione as soluções de carregamento aos frascos. As soluções de carregamento contêm aproximadamente sete micromolar de C-M-F-D-A ou CMRA, respectivamente.
Incube as células por 30 minutos em uma atmosfera controlada. Durante esta primeira incubação, as regiões passam livremente através das membranas celulares para o citosol, onde são transformadas em produtos de reação permeáveis à membrana IMP. Após esta primeira incubação, lave e, em seguida, incube as células com meio de cultura por mais duas horas.
As células são observadas utilizando um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera CCD refrigerada no software de aquisição. Ajuste o comprimento de onda de excitação para 548 nanômetros e escolha um filtro de passagem de banda apropriado para a imagem de fluorescência das células carregadas com CMRA para as células carregadas com C-M-F-D-A. Ajuste o comprimento de onda de excitação para 492 nanômetros e escolha um filtro de passagem de banda para a imagem de fluorescência verde dos olhos de tripsina e conte as células em ambos os frascos, misturando as células vermelhas e verdes em uma proporção de um para um; ajuste a concentração celular para 5 milhões de células por mililitro.
Coloque uma gota de 20 microlitros de suspensão celular no centro de cada poço. Em uma placa de 24 poços, incube as células em atmosfera controlada por 20 minutos para permitir que as células adiram levemente à superfície do poço em uma monocamada e estabeleçam contatos celulares entre si. Coloque a placa com as células sobre a platina do microscópio.
Posicione os eletrodos na parte inferior do poço e conecte-os ao gerador de pulsos. Para obter uma eletrofusão ideal e manter a viabilidade celular, devem ser utilizados parâmetros adequados de pulsos elétricos. Esses parâmetros dependem da linhagem celular e devem ser determinados em experimentos preliminares. Remova o meio de cultura e lave as células com um mililitro de tampão fosfato de potássio ISO omu em 350 microlitros de tampão fosfato de potássio hypos Miller, a fim de induzir o inchaço celular.
Deixe as células em tampão hiperosmótico por dois minutos antes de aplicar os pulsos elétricos. Os pulsos elétricos devem ser aplicados quando as células estiverem próximas aos seus volumes máximos, ou seja, antes de iniciarem a regulação do volume.
Diminuição em nosso experimento. Uma série de oito pulsos retangulares com duração de 100 microssegundos a um hertz foi aplicada. Após a entrega do pulso.
Deixe as células indisturbadas por 10 minutos após 10 minutos. Determine o rendimento de difusão por meio de microscopia de contraste de fase e fluorescência. E adquira três imagens, contraste de fase, fluorescência vermelha e verde, em cinco campos de visão escolhidos aleatoriamente.
Em cada um, criaremos imagens de três canais a partir de cada tríade de imagens no software ImageJ, a fim de melhorar a qualidade visual das imagens para que etapas de pré-processamento possam ser aplicadas às imagens originais, como subtração de fundo e realce de contraste com conjuntos de parâmetros padrão. Por fim, as imagens de três canais são compostas utilizando o plugin RGB para cinza do ImageJ. Nessa imagem, o citoplasma em repouso pode ser observado juntamente com as membranas celulares.
Assim, poucas células podem ser facilmente identificadas na contagem de imagens de três canais, que inclui os três tipos de células: vermelhas, verdes e duplamente fluorescentes. Determine a porcentagem de células duplamente fluorescentes dividindo o número de células duplamente fluorescentes pelo número total de células em cada imagem. O rendimento de fusão é então definido como a porcentagem de células duplamente fluorescentes multiplicada por dois.
Como metade das células de visualização não é detectada quando as visualizações são de células da mesma cor.
Visão Geral
Este vídeo demonstra a eletrofusão eficiente de células in vitro utilizando um método de aderência modificado combinado com eletroporação. O processo inclui a detecção de células fundidas por meio de microscopia de fluorescência.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Técnicas de fusão celular
- Métodos de eletroporação
- Aplicações de microscopia de fluorescência
Contexto
- A eletrofusão é uma técnica que aplica pulsos elétricos para facilitar a fusão celular.
- O método pode aumentar a eficiência na criação de células híbridas.
- A microscopia de fluorescência permite a visualização de células fundidas.
- Compreender a fusão celular é essencial para diversas aplicações biológicas.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método confiável para eletrofusão de células.
- Visualizar e quantificar a eficiência da fusão celular.
- Fornecer um protocolo que possa ser replicado em outros laboratórios.
Métodos Utilizados
- Células de melanoma de camundongo foram cultivadas e preparadas para fusão.
- Corantes fluorescentes foram utilizados para marcar as células antes da fusão.
- Pulsos elétricos foram aplicados para induzir a fusão celular.
- A microscopia de fluorescência foi empregada para analisar os resultados da fusão.
Resultados Principais
- A fusão bem-sucedida de células foi alcançada, conforme indicado pela fluorescência.
- A porcentagem de células duplamente fluorescentes foi calculada para determinar o rendimento da fusão.
- Os parâmetros ideais de pulso elétrico foram identificados para a viabilidade celular.
- A qualidade visual das imagens foi aprimorada por meio de técnicas de processamento de imagem.
Conclusões
- O método de aderência modificado é eficaz para a eletrofusão celular.
- A microscopia de fluorescência é uma ferramenta valiosa para avaliar a eficiência de fusão.
- Este protocolo pode ser adaptado para diversos tipos celulares em pesquisas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A eletrofusão celular visualizada por microscopia de fluorescência fornece uma plataforma não viral e não química para a geração de células híbridas, apoiando pesquisas iniciais na área de biofármacos. A visualização quantitativa de eventos de fusão permite uma avaliação robusta de técnicas de manipulação celular, impactando diretamente a validação de alvos e o desenvolvimento de ensaios. Esta abordagem aumenta a confiança preditiva em fluxos de trabalho baseados em células e orienta decisões de portfólio ajustadas ao risco.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta dos mecanismos de fusão celular relevantes para testes de hipóteses terapêuticas.
- Apoia a validação funcional de estratégias de manipulação celular para a geração de células híbridas.
- Facilita a desmistificação biológica mediante a quantificação da eficiência e especificidade da fusão.
- Fornece resultados mensuráveis para triagem de portfólio e aumento da confiança no alvo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Estabelece sistemas celulares validados para triagem subsequente de fenótipos dependentes de fusão.
- Oferece quantificação padronizada e reprodutível do rendimento de fusão por meio de fluorescência dupla.
- Permite escalabilidade do ensaio e reutilização da plataforma para avaliação de compostos que visam processos de fusão celular.
- Apóia a comparação confiável de protocolos de fusão entre diferentes tipos celulares.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a fluxos de trabalho translacionais ao permitir a geração de células híbridas para modelagem pré-clínica.
- Proporciona continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica de terapias baseadas em células.
- Reduz a ambiguidade mecanicista nas estratégias de manipulação celular para o desenvolvimento terapêutico.
- Apoia o avanço ajustado ao risco de conceitos terapêuticos baseados em fusão celular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a quantificação e visualização robustas da fusão celular, apoiando tanto a validação inicial quanto a pesquisa translacional.
- Biologia da Descoberta: A medição quantitativa do rendimento de fusão apoia a testagem de hipóteses e a clarificação de vias.
- Triagem: Leituras duplas de fluorescência permitem o desenvolvimento reprodutível de ensaios e sua padronização.
- Análises: A quantificação baseada em imagens fornece resultados objetivos e comparáveis para avaliação de condições.
- Pesquisa Translacional: A geração de células híbridas apoia a modelagem pré-clínica e o alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: O fluxo de trabalho é adaptável entre tipos celulares e programas de pesquisa, aumentando o valor da plataforma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em fluxos de trabalho de fusão celular.
- Valor Operacional: Padroniza a quantificação da fusão e favorece a reprodutibilidade entre equipes.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou não prosseguir e melhora a eficiência do capital em programas de fase inicial.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de estratégias terapêuticas baseadas em células.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura celular, microscopia de fluorescência e análise de imagens.
- Necessita de acesso a geradores de pulsos, microscópios de fluorescência e software de processamento de imagens.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de marcação, aquisição de imagens e quantificação.
- A adaptação entre linhagens celulares pode exigir otimização dos parâmetros de pulso e das condições de marcação.
- A eficiência de fusão e a viabilidade dependem da linhagem celular e devem ser determinadas empiricamente.
