Embarque de carga para cinesina Produzido Shuttles Molecular

O objetivo geral deste procedimento é carregar Nanosferas em microtúbulos, que estão deslizando sobre uma superfície revestida com quinase em motores. Isso é realizado primeiramente revestindo a superfície de uma célula de fluxo de vidro com solução de caseína. O segundo passo do procedimento é absorver proteínas motoras de quinesina na superfície da célula de fluxo.

O terceiro passo do procedimento é adicionar os microtúbulos. O passo final do procedimento é adicionar as moléculas de strept haver, que se ligarão aos microtúbulos, e então adicionar as nanoesferas. As nanoesferas se ligam à superfície da câmara de fluxo, onde podem ser capturadas pelos microtúbulos.

Por fim, pode-se observar como as nanosferas são capturadas pelos microtúbulos e transportadas pela superfície utilizando microscopia de fluorescência. Olá, sou Elaine Jen Smith do laboratório do Dr. Henry Hess e do Departamento de Ciência e Engenharia de Materiais da Universidade da Flórida. Hoje mostraremos a vocês um procedimento para o ensaio de motilidade invertido.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o carregamento de carga em microtúbulos e o movimento de transportadores moleculares. Então, vamos começar. Antes do início deste procedimento, prepare recentemente todas as soluções estoque conforme descrito na parte escrita deste vídeo.

Uma vez preparadas as soluções estoque, inicie a preparação dos microtúbulos pipetando 25 microlitros da solução de crescimento em um tubo de microcentrífuga de 0,65 mililitro. Em seguida, adicione 6,25 microlitros da solução de crescimento a 20 microgramas de tubulina biotinilada liofilizada. Vortexie a solução e coloque-a em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos para polimerização. Após a incubação, dilua a solução 100 vezes em Buffer Taxol e vortexie suavemente.

Esta solução serve para estabilizar os microtúbulos. Rotule a solução como vazia 100 e armazene-a em temperatura ambiente. Em seguida, faça uma diluição dez vezes na solução MT 100 em tampão antidesvanecimento e rotule esta solução como MT 1000.

Em seguida, prepare os motores quitinina diluindo a solução de quitinina 20 vezes em tampão TP. Rotule a solução como quitinina em 20 e armazene-a em gelo. Por fim, prepare as soluções de estreptavidina e de nanoesferas.

Primeiro, adicione estreptavidina marcada com Alexa Fluor 5 6 8 até uma concentração de 100 nano molares no Tampão Antifa. Rotule a solução como STV 100, em seguida dilua as nanoesferas 5.000 vezes no Tampão Antifa e rotule esta mistura como NS 5.000. Armazene ambas as soluções sobre gelo.

Após o preparo da solução para o ensaio de carregamento de carga, monte uma câmara de fluxo utilizando uma lâmina e uma lamínula de vidro separadas por fita adesiva dupla face. Primeiro, fixe duas tiras de fita adesiva dupla face nas bordas de uma lâmina, deixando um espaço de aproximadamente um centímetro entre as tiras. Em seguida, posicione a lamínula sobre a fita.

Aplicar pressão sobre a lamínula utilizando a borda plana de uma pinça para fazer um selo. A célula de fluxo construída tem aproximadamente dois centímetros de comprimento, um centímetro de largura e 100 mícrons de altura, e possui um volume de aproximadamente 20 microlitros. Para iniciar a montagem do ensaio invertido.

Coloque a ponta da pipeta entre a lamínula e a lâmina. Em seguida, injete uma solução de caseína a 0,5 miligramas por mililitro na célula de fluxo. Este revestimento na célula de fluxo permitirá que a quinesina mantenha sua funcionalidade após a absorção.

Aguarde cinco minutos para que a solução de caseína recubra. Em seguida, absorva a quinesina na célula de fluxo introduzindo a quinase em solução 20. As soluções são introduzidas nas células de fluxo colocando a ponta da pipeta entre a lamínula e a lâmina. Então, a solução é injetada na célula de fluxo por um lado, enquanto é simultaneamente removida pelo outro lado.

Com papel filtro, aguarde cinco minutos para que a quinase absorva. Em seguida, introduza os microtúbulos na célula de fluxo pipetando a solução MT 1000 na célula de fluxo. Aguarde cinco minutos para que os microtúbulos sedimentem e se liguem aos motores de quinase após a ligação dos microtúbulos aos motores de quinase.

Cubra os microtúbulos com estreptavidina fluorescente TTR introduzindo a solução STV 100 na câmara de fluxo. Aguarde cinco minutos para que as moléculas de estreptavidina TTR se liguem aos microtúbulos. Remova o excesso de estreptavidina TTR realizando três lavagens de 30 microlitros de solução Antifa na câmara de fluxo.

Por fim, introduza as nanoesferas de fluoresceína biotiniladas em poliestireno pipetando a solução NS 5.000 na célula de fluxo. A superfície absorve de forma estacionária. As nanoesferas colidirão com os microtúbulos em movimento e se ligarão a eles.

Neste experimento, utiliza-se um microscópio de fluorescência Eclipse TE 2000 U equipado com uma objetiva de imersão a óleo de 100 x, X site, uma lâmpada de 20 e uma câmera exon E-M-C-C-D. Primeiro, aplique uma gota de óleo de imersão sobre a objetiva. Em seguida, monte a cubeta de fluxo na platina do microscópio utilizando o cubo de filtro trixy.

Coloque os microtúbulos em foco, depois mude para o cubo de filtro fitzy para visualizar as nanoesferas. Em seguida, abra o programa and or I exon e configure o modo de aquisição para cinético. Utilize um tempo de exposição de 0,5 segundos, um comprimento de série cinética de 20 e um tempo de ciclo cinético de seis segundos.

Altere o microscópio do ocular para a câmera e comece a adquirir imagens. Para as primeiras quatro imagens, utilize o cubo trixi para imagens dos microtúbulos. Para as próximas 12 imagens, mude para o cubo de filtro Fitz para adquirir imagens das nanosesferas.

Em seguida, volte para o cubo de filtro trixi. Para as últimas quatro imagens, nas quais se observam os microtúbulos, os microtúbulos são visualizados utilizando o cubo de filtro Trissy; o cubo de filtro é alternado para fite. Para visualizar as nanoesferas aqui, as nanoesferas sendo transportadas pelos microtúbulos são identificadas pelas setas. Nem todas as nanoesferas foram capturadas pelos microtúbulos.

Agora, a localização das nanosesferas é mostrada 36 segundos depois, revelando que as nanosesferas se deslocaram. Quando os microtúbulos são imagiados novamente, fica evidente que eles também se deslocaram pelo campo de visão. Essas imagens demonstram que as nanoesferas foram deslocadas devido ao transporte por microtúbulos.

Acabamos de mostrar como realizar o ensaio de motilidade invertido. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de trocar os cubos de filtro durante a aquisição de imagens para que tanto os microtúbulos quanto as nanoesferas possam ser visualizados. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.