Isolar células-tronco de tecidos moles músculo-esqueléticas

O objetivo geral deste procedimento é isolar células-tronco adultas de tecidos moles músculo-esqueléticos, como o músculo esquelético. Isso é realizado inicialmente por meio da coleta de uma biópsia do tecido mole, seguida de desbridamento e corte fino. O segundo passo do procedimento consiste na digestão enzimática do tecido.

O terceiro passo do procedimento é isolar as células-tronco por meio de etapas repetidas de pré-plaqueamento. O passo final do procedimento é a identificação das células-tronco isoladas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram os comportamentos morfológicos e celulares das células utilizando imunofluorescência, microscopia e/ou citometria de fluxo.

Olá, sou y Lee do Laboratório de Patologia Molecular do Departamento de Cirurgia Ortopédica da Universidade de Pittsburgh. Hoje vou mostrar como isolar uma célula-tronco adulta dos tecidos moles do sistema esquelético de Mus, como o músculo esquelético. Olá, sou o Dr. Johnny Ward.

Sou professor na Escola de Medicina da Universidade de Pittsburgh, no Departamento de Cirurgia Ortopédica. Tenho trabalhado, você sabe, em estreita colaboração com o Dr. Young Lee nesses procedimentos para isolar, você sabe, diferentes tipos de células-tronco do músculo esquelético e tecidos adjacentes, como o tecido padrão. Utilizamos esses procedimentos em nosso laboratório para isolar células-tronco destinadas basicamente a estudos de pesquisa com aplicações em medicina translacional.

Então, vamos começar o estudo. Os tecidos dos quais as células-tronco podem ser isoladas incluem tendões e músculos esqueléticos obtidos dos músculos da tíbia ou sóleo da pata traseira de camundongos selvagens. Após remover os resíduos de pele e osso, coloque os tecidos em uma placa contendo HBSS frio suplementado com 5% de FBS.

Em seguida, coloque o tecido separadamente em placas revestidas com colágeno contendo HBSS frio. Utilizaremos tecidos de músculo esquelético para demonstrar os procedimentos básicos de dissociação e digestão tecidual. Use tesoura microcirúrgica e/ou lâminas de bisturi para picar os tecidos esqueléticos em uma suspensão grossa para digestão enzimática dos tecidos.

Inicie transferindo as suspensões teciduais do MIT para tubos separados de 15 mililitros e centrifugue a aproximadamente 3.500 RPM a quatro graus Celsius por cinco minutos. Remova a lavagem SANE ressuspendendo em HBSS e repita a centrifugação. Após a remoção do sobrenadante, digira as suspensões adicionando 10 mililitros de colagenase 0,2% pré-aquecida.

Incubar o tipo 11 por 60 minutos a 37 graus Celsius, agitando os tubos manualmente a cada 10 minutos. Após a incubação de 60 minutos, centrifugar e, em seguida, ressuspender as suspensões em 10 mililitros de solução DYS. Incubar por 45 minutos a 37 graus Celsius, agitando manualmente a cada 10 minutos. Após a incubação de 45 minutos, centrifugar e ressuspender as suspensões em 10 mililitros de trips a 0,2% em solução HBSS.

Normalmente, incubamos por 15 a 20 minutos a 37 graus Celsius, invertendo os tubos a cada 10 minutos, até que a incubação esteja completa. Quando um número suficiente de células isoladas for liberado dos tecidos, como ilustrado aqui, centrifugue as células resultantes e ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros do meio de proliferação. Dissocie a suspensão celular passando o extrato por uma série de agulhas: duas vezes por uma agulha de 18 gauge, depois uma vez por uma agulha de 23 gauge e, finalmente, uma vez por uma agulha de 27 gauge.

Por último, passe o extrato celular através de um filtro celular de 70 mícrons para iniciar a técnica prepl. Centrifugue o extrato celular recém-preparado e re-suspenda os pellets em meio de proliferação. Plaque cinco mililitros da mistura celular em um frasco T 25 revestido com colágeno e identifique como PP1, incubado a 37 graus Celsius em um incubador umidificado com 5% de dióxido de carbono por duas horas.

Após duas horas, transfira as células não aderentes para um novo frasco T 25 revestido com colágeno e identifique como PP dois. Adicione cinco mililitros de PM ao frasco T 25 anterior identificado como PP um.

Retorne ambos os frascos ao incubador por 24 horas. Após 24 horas, transfira as células não aderentes do PP dois para um novo frasco T 25 revestido com ENC de colágeno e marque-o como PP três. Adicione cinco mililitros de meio de proliferação ao frasco identificado como PP dois.

Retorne os frascos ao incubador. Repita o procedimento a cada 24 horas até a população PP seis. A população de células-tronco é criada.

As células isoladas do PP seis são muito poucas em número e precisam ser mantidas em um meio de proliferação rico em soro bovino fetal. Esse meio é trocado diariamente. Embora a maioria das células na cultura do PP seis morra durante as próximas uma a duas semanas de cultivo.

Uma população grande e saudável de PP seis geralmente é criada após uma expansão adicional de uma a duas semanas. Mantenha também todos os outros grupos de células suspensas, permitindo que proliferem e examinando-os regularmente com um microscópio invertido. As células aderentes precoces que se ligam aos frascos PP um e PP dois são principalmente células fibroticas.

Células que aderem a frascos revestidos com colágeno após um período mais longo, entre 48 e 96 horas. PP três e PP quatro são principalmente mioblastos. Enquanto células satélite musculares são frequentemente observadas principalmente na PP cinco, as pré-pl células posteriores, 96 horas ou mais tarde, PP seis, são consideradas células-tronco adultas e apresentam-se pequenas, arredondadas e translúcidas.

No início do seu isolamento, eles podem ser ainda caracterizados por imuno-histoquímica quanto à expressão de marcadores de células-tronco, como célula-tronco, antígeno um e CDC 34. Acabamos de mostrar como isolar células-tronco de uma massa secundária do camundongo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de manter o esteroide durante todos os passos.

Uma vez que a célula-tronco tenha sido isolada, certifique-se de cultivar essas células em baixa densidade para manter as características das células-tronco. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com o seu experimento. Desejo-lhe sucesso ao tentar utilizar isso em seu experimento.

Obrigado.