Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro

A migração dos linfócitos T ocorre durante a homing para órgãos linfoides, a saída da vasculatura e a entrada em tecidos periféricos. Esse processo envolve a interação adesiva da superfície dos linfócitos T com outras células. Para examinar esse fenômeno in vitro, linfócitos T humanos são isolados, cultivados e colocados em placas de cultura celular revestidas com a proteína adesiva.

ICAM um e quimiocina SDF um. Em seguida, podem ser adquiridas e analisadas imagens da migração de linfócitos T. Olá, sou Craig LeFort e do laboratório de Minsu Kim no Centro de Biologia de Vacinas e Imunologia na Universidade de Rochester.

Hoje vamos mostrar um procedimento para o isolamento e cultivo de linfócitos de adolescentes humanos e uma análise de sua migração in vitro. Utilizamos este ensaio em nosso laboratório para estudar o papel das integrinas e da migração de linfócitos T. A principal integrina em linfócitos T é o antígeno associado à função linfocitária um, ou LFA-1.

Os ligantes específicos para a LFA um são as ICAs, como a ICAM um. Além disso, um sinal químico é necessário para a migração de linfócitos T, fornecendo tanto um sinal de direcionalidade quanto a ativação de integrinas. Em nosso ensaio, utilizamos ICAM um humana e CX CL 12 ou SDF um como substratos para a migração de linfócitos T.

Então vamos começar. Após obter sangue humano de um doador saudável, deixe o sangue esfriar até a temperatura ambiente. Isso leva cerca de 30 minutos.

Uma vez que o sangue esteja resfriado, pipete cuidadosamente três mililitros de meio de gradiente de densidade de polimorfo à temperatura ambiente em um tubo de poliestireno redondo de oito mililitros. Em seguida, adicione cuidadosamente três mililitros de sangue total por cima. É importante evitar qualquer mistura.

Coloque os tubos em uma centrífuga e gire a 500 G por 45 minutos. À temperatura ambiente, após a centrifugação, as células mononucleares do sangue periférico ou PBMCs foram separadas dos demais componentes sanguíneos. A camada de PBMCs aparece como a primeira faixa turva a partir do topo.

Em condições estéreis, remova e descarte cuidadosamente a fase superior de cor amarela clara. Em seguida, utilize uma micropipeta P 1000 para transferir a camada de PBMC para um novo tubo cônico. Lave os PBMC duas vezes com PBS, centrifugando as células a 500 G por cinco minutos.

Toda vez que o sobrenatante ficará um pouco turvo após cada lavagem. Suspender novamente as células em 20 mililitros de meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina e um micrograma por mililitro. A incubação com fito-hemaglutinina ou PHA na presença de PHA induz a ativação e expansão dos linfócitos T.

Usando uma pipeta, transfira os PBMCs para um frasco de cultura T 75. Em seguida, incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por um a 24 horas. Este passo permite que os monócitos, que aderirão à superfície do frasco, sejam separados dos linfócitos que permanecem em suspensão.

Após a incubação, remova cuidadosamente todo o meio, que contém principalmente linfócitos, e transfira-o para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue a 500 ×g durante cinco minutos. Resuspenda o pellet celular em RPMI 1640 e transfira as células para um novo frasco T-75 contendo 25 mililitros de RPMI 1640 com FBS, penicilina, estreptomicina e PHA, incubado a 37 graus Celsius.

Após 24 horas de crescimento, pode ser necessário adicionar de 15 a 20 mililitros de meio fresco e transferir para um frasco T 1 75 maior. Continue a incubação por três dias ou dois dias. Se a incubação inicial dos PBMC foi durante a noite após três dias, use uma pipeta para remover o meio, que conterá linfócitos suspensos, e transfira para um tubo cônico de 50 mililitros, centrifugando a 500 G por cinco minutos.

Resuspendeu o pellet celular e transferiu as células para um novo frasco T75 contendo 25 mililitros de RPMI 1640 com FBS, penicilina, estreptomicina e IL-2 humana ou IL-15. Coloque as células no incubador. Se iniciar um frasco T75, a cultura precisará ser expandida e transferida para um frasco T175.

Após um a dois dias, cultive os linfócitos por um total de quatro a sete dias. Um dia antes do ensaio de migração, recubra uma placa com fundo de vidro de 0,17 milímetro com 20 microgramas por mililitro de proteína A ou G em PBS e incube durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Lave a placa extensivamente com PBS, depois adicione ICAM um FC e SD F1 humano em solução de PBS à placa.

Incube por quatro horas à temperatura ambiente para imobilizar as moléculas. Determine a densidade das células cultivadas utilizando um hemocitômetro. Em seguida, lave os linfócitos duas vezes com PBS e re-suspenda-os em um mililitro de meio L 15 contendo D glucose. Após a incubação, lave a placa revestida com ICAM one FC e SDF one extensivamente com PBS, transfira os linfócitos T em um mililitro de meio para a placa; aproximadamente de duas a cinco vezes 10 à quinta célula devem ser utilizadas por placa para obter uma densidade celular apropriada para análise de migração.

Para obter imagens da migração celular, coloque a placa na platina do microscópio em um ambiente controlado termicamente, como uma câmara aquecida a 37 graus Celsius. Abra o software NIS Elements no menu de configurações de imagem. Escolha o modo de binning dois por dois tanto para a aquisição de imagens em tempo real quanto para a captura de imagens.

Vá ao menu de aplicações e escolha, defina, execute, experimente. Escolha o intervalo de tempo entre as imagens e o tempo total. Para a sequência de captura de imagens, pressione o botão executar para iniciar a aquisição de imagens após a aquisição.

Parâmetros de migração, como velocidade, comprimento do trajeto e deslocamento, podem ser quantificados utilizando um pacote de software como Image J Auto Quant ou veloc. Para gerar um gráfico de teia de aranha, colete as coordenadas XY para cada célula e ponto temporal e projete-as em um gráfico com um ponto inicial comum para cada célula na origem. Os linfócitos T mostrados aqui foram cultivados em placas com ICAM e SDF um e imageados a cada 10 segundos durante 30 minutos.

Este vídeo mostra a migração aleatória de linfócitos T com uma velocidade de aproximadamente 15 mícrons por minuto, utilizando as coordenadas XYT para cada célula. Quinze células foram escolhidas aleatoriamente e representadas graficamente com um ponto inicial comum na origem. A comparação de gráficos em formato de teia de aranha fornece uma representação visual rápida das diferenças na migração entre diferentes condições experimentais.

Os gráficos da migração de linfócitos T sob condições de controle são mostrados à esquerda, enquanto os gráficos da migração de linfócitos T na presença de um anticorpo bloqueador do ligante anti-LFA-1 são mostrados à direita. Esses dados demonstram que os linfócitos T utilizam a integrina LFA-1 para migrar sobre um substrato de ICAM-1. Acabamos de mostrar como realizar um ensaio de migração utilizando linfócitos T humanos cultivados durante o procedimento.

É importante lembrar de adicionar um número apropriado de células ao recipiente revestido com ICAM-1 para que o rastreamento celular e a análise da migração sejam simplificados. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.