A abordagem inversa Genética para Teste de Redundância funcional durante a embriogênese
11 de agosto de 2010
A função do gene pode ser obscurecida na perda de função experimentos se houver compensação por outro gene. O modelo de zebrafish fornece um relativamente alto rendimento significa revelar redundância funcional como em embriões vivos.
O objetivo geral deste procedimento é determinar se dois genes são funcionalmente redundantes na especificação de uma linhagem celular definida. Isso é realizado primeiramente definindo o fenótipo de perda de função de cada gene individual por meio de morphos específicos para o gene, injetados em embriões de peixe-zebra em desenvolvimento. O segundo passo do procedimento consiste em desenvolver um ensaio para quantificar a especificação ou diferenciação da linhagem celular.
Por exemplo, utilizando uma linhagem de peixes repórter, como mostraremos aqui. O terceiro passo do procedimento é combinar dois morph FENO para direcionar a perda de função de ambos os genes simultaneamente. O passo final do procedimento é avaliar o fenótipo causado pela dupla inibição.
No fim, podem ser obtidos resultados que demonstram perda ou ganho de função para células de uma linhagem específica por meio da análise do repórter de linhagem ou da avaliação da expressão de marcadores específicos da linhagem. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a combinação de genes nulos no modelo de camundongo, é que dois ou mesmo três genes podem ser alvejados no modelo de peixe simplesmente combinando morphos validados em um único experimento. Mais de 100 embriões podem ser injetados e os fenótipos avaliados ao longo de vários dias.
Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais. Na biologia do desenvolvimento, como na definição das vias transcripcionais que controlam o destino celular, as vias reguladoras principais são frequentemente representadas por pequenas famílias de genes relacionados que são funcionalmente redundantes. Seu papel, portanto, não é evidente em estudos de eliminação em camundongos devido à compensação por Genes Irmãos.
Embora este modelo possa fornecer informações sobre a embriogênese de peixe-zebra, os resultados podem ser aplicados a outros sistemas, como o de camundongo, já que os mesmos programas genéticos geralmente são bem conservados ao longo da evolução. Prepare placas para microinjeção antes de injetar os embriões. Despeje aproximadamente 12 mililitros de ágar a 2% em água do sistema, que é água limpa retirada diretamente do sistema do aquário, na tampa invertida de uma placa de Petri de 100 milímetros.
Posicione dois lâminas de microscópio em ângulos aproximados de 45 graus nos dois lados da tampa. Quando o agarose tiver solidificado, retire cuidadosamente as lâminas da tampa, criando canais onde os embriões ficarão posicionados durante a injeção. Os morfos são mantidos à temperatura ambiente em uma concentração de um milimolar em água destilada estéril e desionizada antes da injeção. Incube os estoques de morfos a 65 graus Celsius por cinco minutos para garantir que estejam completamente em solução.
Deixe os estoques esfriarem até a temperatura ambiente. Cada morfo recém-projetado deve ser validado empiricamente quanto à atividade e à tolerância do embrião. Em tubos de microcentrífuga, inicie com uma a duas diluições seriadas do morfo estoque em água destilada e desionizada, obtendo concentrações de trabalho de um milimolar, 0,5 milimolar, 0,25 milimolar e 0,125 milimolar.
Sob um microscópio estereoscópico, use sucção para carregar anteriormente uma agulha de injeção calibrada que foi fixada ao micromanipulador e corretamente posicionada. Carregue a agulha com aproximadamente um microlitro da solução morfo de menor concentração. Utilize uma pipeta de transferência para mover embriões fertilizados de uma célula para as canaletas da placa de microinjeção.
Use a pipeta para remover o excesso de água da placa, de modo que os embriões caiam para o fundo do sulco. Posicione a placa de injeção sob o microscópio, desça a agulha através do córion e até a gema. Injete cada embrião antes de retirar a agulha e reposicionar a placa de injeção para acessar o próximo embrião.
Ao aprender a realizar injeções, pode ser útil usar um corante vital para visualizar a injeção na célula, conforme mostrado aqui, transferir os embriões de volta para uma placa de Petri de 100 milímetros com água do sistema e cultivá-los a 28,5 graus Celsius. Expulse qualquer solução restante de morpho da agulha e preencha-a com a próxima concentração mais alta de morpho para injetar o próximo lote de embriões em um estágio apropriado de desenvolvimento. Examine os embriões quanto a fenótipos em cada concentração injetada de morpho.
A dose limiar para cada morfo é a menor dose na qual há um fenótipo definido e confiável. Várias rodadas de titulação podem ser necessárias para definir com precisão a dose limiar. Para investigar uma interação genética entre dois genes distintos.
Prepare uma mistura de dois morphos de interesse, cada um na sua respectiva concentração limiar. É importante ter em mente que os embriões podem não tolerar mais de 20 nanogramas de morpho no total por injeção. Injete os embriões da mesma maneira que anteriormente.
Mantenha os volumes de injeção constantes entre os grupos experimentais e controles, que devem incluir conjuntos injetados com cada morfolino isoladamente sob o microscópio estereoscópico. Monitore os embriões injetados imediatamente após a injeção e várias vezes ao longo do dia; utilize uma pipeta de transferência para remover qualquer embrião morto ou moribundo. Como esses podem comprometer a viabilidade dos embriões restantes, mova com uma pipeta de transferência os embriões sedados ou eutanasiados a qualquer momento.
Aponte para uma lâmina de depressão para observação. Para fotografia. Use pinça fina para remover o córion, se necessário.
Estabilize o embrião em uma gota de metilcelulose a 3%. Analise os embriões em busca de um fenótipo distinto, exclusivo da combinação de morfós, em vez de uma penetrância maior do fenótipo de morfós individuais. Abaixo estão vários embriões selvagens injetados com morfós no limiar. Para gata5, o fenótipo típico é cardia bifida ou dois corações, porque os progenitores não conseguiram se fundir na linha média.
Observe os cardiomiócitos positivos para GFP indicados pelas setas. O fenótipo para seis morfinas inclui corações malformados que não realizam corretamente a alçação. Esses embriões também desenvolvem cardiomiócitos positivos para GFP.
No entanto, os embriões injetados com uma combinação dos morpholinos de gata five e gata six mostrados aqui exibem perda total do desenvolvimento de cardiomiócitos, indicando que gata five ou gata six precisa ser expresso para que os cardiomiócitos se desenvolvam. Os dois genes são funcionalmente redundantes na especificação de cardiomiócitos.
Ao tentar este procedimento, é importante primeiro validar completamente seus morfos e ter a maior certeza possível de que eles representam uma redução efetiva de um único gene alvo após a realização deste procedimento. Outros métodos, como a combinação de alelos nulos condicionais em camundongos, podem ser realizados para demonstrar que os mesmos genes exercem função semelhante também em mamíferos.
Após assistir ao vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar se dois genes são funcionalmente redundantes durante a embriogênese.
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Visão Geral
Este estudo investiga a redundância funcional de genes em embriões de peixe-zebra, que pode obscurecer a função gênica em experimentos de perda de função. Ao empregar um modelo de alto rendimento, os pesquisadores podem revelar mecanismos compensatórios entre genes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Genética
- Biologia do Desenvolvimento
Antecedentes
- A função gênica pode ser mascarada por ações compensatórias de outros genes.
- O peixe-zebra serve como organismo modelo para o estudo de interações gênicas.
- Experimentos de perda de função são cruciais para compreender os papéis dos genes.
- A redundância funcional pode complicar a interpretação de estudos de silenciamento gênico.
Objetivo do Estudo
- Determinar se dois genes são funcionalmente redundantes na especificação da linhagem celular.
- Avaliar o impacto do silenciamento simultâneo de genes sobre fenótipos.
- Desenvolver um ensaio quantificável para diferenciação da linhagem celular.
Métodos Utilizados
- Injeção de morpholinos específicos para genes em embriões de peixe-zebra.
- Utilização de linhagens de peixes repórter para ensaios de especificação de linhagem.
- Combinação de morpholinos para experimentos de silenciamento duplo.
- Avaliação dos fenótipos resultantes do silenciamento duplo.
Resultados Principais
- Identificação de fenótipos de perda de função para genes individuais.
- Quantificação bem-sucedida da especificação da linhagem celular.
- Demonstração de redundância funcional entre genes alvo.
- Compreensão dos mecanismos compensatórios na função gênica.
Conclusões
- O modelo de peixe-zebra é eficaz para estudar a redundância gênica.
- A supressão simultânea de genes revela interações gênicas complexas.
- Compreender a redundância funcional é essencial para a análise da função gênica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A redundância funcional em famílias gênicas pode obscurecer a validação de alvos na fase inicial de descoberta, levando a falsos negativos em triagens fenotípicas. Essa abordagem genética reversa baseada em peixe-zebra permite a investigação em alto rendimento de mecanismos compensatórios, aumentando a confiança no alvo e reduzindo os riscos na identificação de compostos promissores. Ao revelar interações genéticas por meio de co-silenciamento sublimiar, o método possibilita a modelagem preditiva da essencialidade gênica em sistemas vertebrados.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar interações genéticas e compensação funcional entre genes relacionados.
- Valor Operacional: Utiliza titulação de morpholino para estabelecer doses limiares para silenciamento individual e combinado.
- Valor Preditivo: Revela resultados fenotípicos somente quando ambos os genes são suprimidos, indicando redundância funcional.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Utiliza linhagens de peixes repórter para quantificar a especificação de cardiomiócitos como leitura específica de linhagem.
- Valor Operacional: Permite a injeção e fenotipagem de mais de 100 embriões por experimento, possibilitando triagem em escala.
- Prontidão do Ensaio: Gera fenótipos quantitativos e visualmente distintos (por exemplo, cardio bifida, falha no looping cardíaco) para avaliação de linhagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Descobertas na cardiogênese de peixe-zebra são aplicáveis a sistemas mamíferos devido à conservação de programas genéticos.
- Redução de Riscos Mecanística: Esclarece se os fenótipos observados decorrem da perda de um único gene ou exigem perturbação combinatória.
- Apoio a Modelos Pré-clínicos: Fornece uma plataforma baseada em peixe-zebra para validar redundância de alvos antes do investimento em modelos mamíferos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase inicial de descoberta para validar alvos e reduzir riscos de hipóteses antes da identificação de compostos líderes, especialmente para famílias gênicas com membros compensatórios.
- Biologia da Descoberta: Testa reguladores transcricionais, como fatores GATA, quanto a papéis redundantes na especificação do destino celular.
- Triagem: Estabelece dosagens padronizadas de morpholino e pontuação fenotípica para avaliação reprodutível de linhagens.
- Análises: Utiliza a penetrância fenotípica e a expressão do marcador de linhagem para comparar os efeitos do silenciamento simples e duplo.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas sobre embriogênese em peixe-zebra a vias conservadas em vertebrados superiores.
- Reutilização Empresarial: Os protocolos de validação e injeção de morpholino podem ser adaptados a outros pares de genes ou processos de desenvolvimento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao distinguir interações genéticas reais de mascaramento compensatório.
- Valor Operacional: Permite injeção padronizada de embriões e fenotipagem em alto rendimento em múltiplas concentrações.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguir ou não ao revelar dependências ocultas em redes alvo.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos ao identificar redundâncias que poderiam comprometer a eficácia da monoterapia.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em embriogênese de peixe-zebra, microinjeção e validação do desenho de morpholinos.
- Depende de aparelho de microinjeção, microscopia de fluorescência e sistemas de cultura de embriões a 28,5°C.
- Necessita padronização entre equipes no armazenamento de morpholinos, titulação e controle do volume de injeção.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes alvos genéticos, incluindo limiares de solubilidade e toxicidade.
- Limitado pela tolerância dos embriões, com a dosagem total de morpholino restrita para evitar efeitos não específicos (≤20 ng por injeção).
