Visualização e Quantificação de Interações intracelulares de Neisseria meningitidis Humanos e α-actinina por Imagem Confocal

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar o nível de colocalização de bactérias internalizadas, *Ria meningitidis*, com a proteína do citoesqueleto alfa-actinina. Isso é realizado infectando-se células microvasculares cerebrais humanas cultivadas com uma cultura bacteriana de crescimento noturno, por três a oito horas, permitindo que as bactérias entrem nas células-alvo. Como segundo passo, as células com bactérias intracelulares são lavadas, fixadas e, em seguida, permeabilizadas, preparando o cultivo infectado para a imunomarcação das bactérias internalizadas e da alfa-actinina intracelular.

Após a obtenção das imagens confocais e a aplicação de software de colocalização, podem ser observadas imagens da colocalização intracelular e obtidos resultados quantificados que demonstram que o OPC Meninga Croci e também a proteína de membrana podem interagir especificamente com a alfa-actinina intracelular com base na visualização microscópica confocal e na análise quantitativa de colocalização. Olá, sou Isel Maria do Laboratório da Professora Mata TI do Departamento de Medicina Celular e Molecular da Universidade de Bri. Hoje mostraremos a vocês um procedimento para estimativa do nível de col, razão entre bactérias intracelulares e proteínas do citoesqueleto.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar uma interação entre o meningococo micelial que expressa uma proteína de membrana auto-OPC e a proteína do citoesqueleto alfa-actina. Vamos começar. Este trabalho deve ser realizado em um laboratório de segurança adequado.

Dois dias antes do procedimento de imunomarcação, inocular a cepa bacteriana de interesse em ágar infusão cérebro-coracão suplementado com 10% de sangue de cavalo aquecido. Incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius em atmosfera com 5% de dióxido de carbono no dia anterior à imunomarcação. Utilizar uma alça de cultura de 10 microlitros para preparar uma suspensão da cultura bacteriana de crescimento noturno.

Em dois mililitros de PBSB, deixe a suspensão repousar por cinco minutos à temperatura ambiente para permitir que grandes agregados bacterianos sedimentem. Em seguida, transfira o primeiro mililitro da suspensão para um tubo estéril sem perturbar o pellet, solubilizando as bactérias ao adicionar um mililitro de SDS 1% e hidróxido de sódio 0,1 molar a dois frascos contendo 20 microlitros de suspensão bacteriana e inverta o tubo para homogeneizar. Para estimar o número de bactérias.

Meça o conteúdo de ácidos nucleicos determinando a absorbância da solução. Em 216 anteras, ajuste a suspensão bacteriana à densidade requerida no meio de infecção para infectar as células endoteliais microvasculares do cérebro humano. Células endoteliais microvasculares do cérebro humano ou H-B-M-E-C-A semeadas dois dias antes da imunomarcação colocaram lâminas de vidro de 16 milímetros nas cavidades de uma placa de 12 poços e semaram as HBME em 50% de confluência sobre as lâminas, incubando durante a noite a 37 graus Celsius em atmosfera de 5% de dióxido de carbono; no dia seguinte.

Infecte as células com a suspensão bacteriana recém-preparada em nosso laboratório. Uma razão de infecção de 200 a 300 unidades formadoras de colônia por célula-alvo é rotineiramente utilizada. Incube por três a oito horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono ao final do período de infecção.

Lave as células três vezes com PBS e fixe em 500 microlitros de paraformaldeído 2% por 30 a 45 minutos à temperatura ambiente. Após a remoção do paraformaldeído, permeabilize as células fixadas com paraformaldeído incubando em Triton X-100 0,1% diluído em PBS por 10 minutos. Por fim, lave as amostras três vezes com PBS e prossiga para a imunomarcação conforme indicado. A seguir, a marcação de bactérias intracelulares e de actinina pode ser realizada simultaneamente.

Em placas de 12 poços, bloquee as lamínulas contendo as células permeabilizadas com 500 microlitros de B-S-A-P-B-S-T a 3% por 30 a 60 minutos. Após lavagem com PBS, transfira cada lamínula para um novo poço seco na placa de 12 poços, à temperatura ambiente. Adicione simultaneamente os anticorpos primários contra bactérias e alfa actinina; 80 a 100 microlitros de anticorpo por lamínula são suficientes, desde que adicionados cuidadosamente para cobrir a superfície da lamínula. Incube por uma hora à temperatura ambiente. Ao final da incubação, adicione 200 microlitros de PBS ao poço, levante a lamínula e coloque-a em um novo poço contendo 500 microlitros de PBS. Após cinco minutos, remova o PBS por pipetagem e adicione PBS fresco. Repita duas vezes e transfira as lamínulas para um novo poço seco.

Em seguida, adicione os anticorpos secundários apropriados conjugados a diferentes fluorocromos, diluídos em PBST com 1% de BSA. Incube à temperatura ambiente por uma hora no escuro. No final da incubação, lave conforme descrito anteriormente. Em seguida, contraclare o DNA com DPI por cinco minutos à temperatura ambiente no escuro. Ao final dessa incubação, lave as lamínulas uma vez em PBS e, então, monte com uma gota de meio de montagem. As lamínulas montadas devem ser armazenadas no escuro até o momento da observação. Sob o microscópio, observamos e capturamos imagens das nossas amostras imunomarcadas utilizando um microscópio confocal de varredura a laser acoplado a um microscópio invertido de fluorescência por epifluorescência.

Para iniciar o procedimento de microscopia confocal a laser, adicione uma gota de óleo de imersão à objetiva e coloque a lâmina do espécime com a lamínula voltada para baixo na platina do microscópio. Ajuste o microscópio para o modo visual e localize a área de interesse utilizando as oculares do microscópio. Agora estamos prontos para utilizar o software da Leica. Selecione o modo de aquisição XY zed. Escolha o formato cinco 12 por cinco 12 para estudos de colocalização.

Quanto maior a resolução, mais precisa será a imagem. Em seguida, selecione o modo X bidirecional, o que aumentará a velocidade de varredura e ajudará a reduzir o desbotamento da imagem. Configure as configurações de varredura sequencial.

Clique na função SEC e depois selecione entre as linhas. Selecione os feixes de laser de acordo com os fluorocromos conjugados aos anticorpos secundários. 4 0 5 nanômetros para DPI, 4 88 nanômetros para Alexa Fluor 4 88 e 5 61 nanômetros.

Para trixy, ative respectivamente o tubo fotomultiplicador um, dois e três. Configure o topo e a base da pilha ou série Z. Em seguida, defina o tamanho do passo Z como 0,2 micrômetros.

RIA Mencius é um diplococo e, como cada caco tem um diâmetro aproximado de 0,5 micrômetros, um tamanho de passo Z de 0,2 micrômetros aumenta a probabilidade de escanear cada caco pelo menos duas vezes. Defina os parâmetros finais de varredura selecionando uma média de três linhas para melhorar a relação sinal-ruído, clicando em iniciar. Imagens dupla ou triplamente coradas são obtidas por meio de varredura sequencial em diferentes comprimentos de onda e utilizando o modo entre linhas para cada canal, a fim de eliminar a interferência entre os diferentes cromóforos.

Para indicar a colocalização de dois fluorocromos, selecione a função de sobreposição para mesclar os canais selecionados em uma única imagem. Por exemplo, quando os fluorocromos Alexa 4 88 e trissy Fluor colocalizarem, uma cor amarela aparecerá na imagem sobreposta. Para uma reconstrução 2D necessária à visualização da possível colocalização, compile a pilha Z ou série utilizando a função de projeção máxima. Após adquirir a pilha Z ou série, processe seus dados para obter uma imagem ortogonal para a visualização da localização intracelular de vários elementos.

A quantificação da colocalização é realizada utilizando o software Vol City da IMP provision. Para começar, crie uma biblioteca com imagens de microscopia confocal (CLSM), selecione o foco estendido na imagem na barra superior. Esta ferramenta combinará os planos Z em uma imagem 2D para ser analisada.

Agora selecione a ferramenta de COLICALIZAÇÃO. Os dois canais a serem analisados devem ter a mesma profundidade de cor. Selecione a área que será quantificada.

Defina o limiar para remover qualquer fundo. Crie a saída de colocalização selecionando gerar colocalização. As estatísticas de colocalização serão geradas para as regiões de interesse selecionadas anteriormente.

Em seguida, selecione os coeficientes de Mander R e ny. Por fim, exporte os valores estatísticos para um documento Excel para apresentação dos dados, conforme mostrado aqui com resultados representativos de imagens confocais de células endoteliais cerebrais humanas infectadas com meninga cockeye por oito horas. A localização das bactérias é mostrada em vermelho.

Embora a localização da alfa-actinina seja mostrada em verde, setas indicam regiões onde parece ter ocorrido um alto grau de acúmulo de alfa-actinina ao redor de bactérias. Nesta imagem de sobreposição, há várias regiões nas quais aparece uma cor amarelo-alaranjada, sugerindo colocalização entre *meninga occi* e alfa-actinina. Nesta próxima imagem, uma dissecação óptica de uma monocamada de H-B-M-E-C infectada indica colocalização ao redor de bactérias intracelulares localizadas na base de uma célula.

Quando imagens tridimensionais de monocamadas de H-B-M-E-C infectadas foram processadas, uma visão oblíqua da superfície apical mostra uma bactéria Durant corada em vermelho, indicada pela seta vermelha, onde várias bactérias estão localizadas em direção às superfícies basais das células endoteliais, indicadas pela seta amarela. Uma localização basal distinta, de cor laranja-amarelada, pode ser vista com mais clareza nesta seção transversal XZ do endon. Em contraste com experimentos distantes de actinina, nos quais foi realizada a marcação de bactérias internalizadas e de menton ou actina, observa-se ocasional colocalização com actina, mas rara colocalização com fermentação em células H-B-M-E-C.

Como observado nos experimentos anteriores, a retina estava concentrada ao redor de várias bactérias internalizadas indicadas pelas setas brancas. Os dados também foram analisados para obter a sobreposição relativa. O coeficiente R, que, segundo Manda, representa o verdadeiro grau de colocalização IE, ou seja, o número de pixels que colocalizam em comparação com o número total de pixels, e os valores NY para alfa-actinina, mentina e actina no geral em H-B-M-E-C infectadas com OPC expressando meningococos, mostraram mais de 25% de sobreposição da retina com meningococos.

O coeficiente e Y é uma medida da frequência de uma moeda do sinal de recompensa mais abundante cada vez que ocorre o sinal de meninga cocoa menos abundante. Esta medida mostra um nível acentuado de ocorrência de alfa-actinina nas proximidades de meninga cockeye internalizada. Mostramos aqui como visualizar e quantificar a introdução de bactérias internalizadas com elementos do citoesqueleto dentro deste experimento.

É importante lembrar de seguir rigorosamente os protocolos de fixação e imunomarcação para manter a integridade das estruturas e evitar um fundo elevado. Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.