Administração oral de rotenona usando um Gavage e Análise de Imagem de Alpha-sinucleína Inclusões no sistema nervoso entérico

Os sintomas da doença de Parkinson, incluindo disfunções motoras e da fala, resultam da atividade reduzida de células secretoras de dopamina no cérebro. O sistema nervoso entérico e o bulbo olfatório são as estruturas nervosas mais expostas e as primeiras a serem afetadas. A doença de Parkinson tem sido associada à exposição a pesticidas.

Para analisar os efeitos de pesticidas no sistema nervoso entérico, o pesticida roone é administrado a camundongos por gavagem oral. Em seguida, os camundongos são perfundidos por via intracardíaca com paraform 4%, aldeído cérebro e sistema nervoso entérico. O tecido é extraído, preparado e submetido à imuno-histoquímica para proteínas associadas à DP.

Imagens de beta três tubulina e alfa sinucleína adquiridas por microscopia confocal demonstram o acúmulo de alfa sinucleína dentro dos neurônios do sistema nervoso entérico em animais expostos a pesticidas. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a administração sistêmica de rotenona, é que, ao utilizar esta técnica, garante-se que o efeito da rotenona esteja confinado ao sistema nervoso entérico. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na doença de Parkinson, como sua etiologia e os mecanismos subjacentes à sua progressão.

As implicações desta técnica se estendem à terapia e ao diagnóstico da doença de Parkinson, pois permitirão o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos e métodos diagnósticos. Embora este método possa fornecer informações sobre a fisiopatologia da doença de Parkinson, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como o estudo do efeito de outras toxinas ambientais sobre os sistemas nervosos entérico, simpático e parassimpático, bem como sobre a parede intestinal. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldades, pois leva algum tempo para dominar a gavagem.

Tive pela primeira vez a ideia desses métodos ao ler sobre a ligação entre pesticidas e a doença de Parkinson. Também foi útil ver a conferência de alta CORA no Congresso Mundial sobre Parkinson em Berlim em 2005. A demonstração pacífica deste método é necessária.

O método para administrar ol por meio de gavagem é difícil, pois os camundongos possuem uma anatomia diferente da humana; por outro lado, a análise de imagem foi realizada com etapas personalizadas para essas imagens. Inicie o protocolo pesando o animal. Calcule o volume apropriado de rotenona.

São necessários 0,01 mililitros por grama do peso do animal, o que corresponde a uma dose de cinco miligramas por quilograma de roone. Carregue uma seringa de um mililitro com a solução de roone e, em seguida, carregue uma segunda seringa com a solução veicular. Pegue o camundongo e segure a cauda do animal com uma mão.

Estique a pele do pescoço puxando-a com os dois primeiros dedos da outra mão. Uma vez que a cabeça esteja fixada entre os dois dedos, apoie-a contra a palma da mão e vire-a de cabeça para baixo. Fixe a cauda.

Usando o quarto e o quinto dedos, mantendo a cabeça voltada para trás, pressione o palato para abrir a boca do camundongo. Introduza suavemente a sonda de gavagem na boca. Mova lentamente a sonda em direção ao estômago até que todo o seu comprimento seja inserido.

Para evitar que o material entre nos pulmões, administre a solução de roone ou o veículo pressionando suavemente o embolo. Após a conclusão, retire lentamente a gavagem e coloque o animal em outra gaiola até que todos os animais de uma mesma gaiola sejam tratados. Após o tratamento, os camundongos são perfundidos intracardiacamente com paraformaldeído a 4%.

Em PBS, os intestinos são então extraídos por dissecação e colocados em sacarose a 15% durante a noite. No dia seguinte, o tecido é transferido para sacarose a 30% e incubado novamente durante a noite a quatro graus Celsius. O tecido é então colocado em um congelador a menos 80 graus Celsius e armazenado até o uso. Usando um criostato, o intestino de 20 mícrons.

As seções transversais são transferidas para lâminas de microscópio, seguidas de bloqueio e procedimentos de imuno-histoquímica. Em seguida, são realizadas as marcações com anticorpos anti beta três tubulina e anti alfa sinucleína. Recomenda-se que uma pessoa externa realize uma análise cega dos dados.

Para iniciar a análise, abra o software Fiji. Abra o arquivo da imagem confocal. Em seguida, separe os canais para que seja possível trabalhar em cada canal independentemente.

Feche os canais que não serão utilizados e selecione, analise, defina, dimensione e ajuste o tamanho do pixel para um. Defina a distância conhecida como 0,13 e clique em global. O tamanho da imagem será agora exibido em mícrons.

Selecione o canal da alfa-sinucleína e selecione o gânglio. Certifique-se de que a seleção envolva o gânglio em todos os cortes. Duplique a imagem com o gânglio selecionado; apenas uma imagem do tamanho do gânglio será duplicada.

Pressione editar para limpar; a área fora da região selecionada na imagem ficará preta. Duplicar a imagem novamente para determinar o quão bem o procedimento foi realizado. Imagens com uma baixa relação sinal/ruído de fundo não devem ser usadas para análise de imagem.

Selecione a imagem e ajuste o limiar. Em seguida, selecione entropia máxima. Depois, percorra as fatias na imagem recortada e na original para garantir que o procedimento tenha sido bem-sucedido.

O limiar de limiarização seleciona um nível de sinal de intensidade com base no histograma da imagem, e somente os pixels com intensidades superiores a esse limiar serão exibidos em um processo de seleção de imagem em branco sobre preto. Em seguida, clique em suavizar. Esta etapa transforma as bordas pixelizadas das imagens em bordas suaves no processo de seleção.

Em seguida, clique em binário e escolha Fazer binário. A imagem será exibida como uma imagem preta sobre fundo branco. Duplique a imagem para realizar a próxima etapa na imagem duplicada, clique em analisar, analisar partículas. Em seguida, selecione mostrar contornos e clique em resumir.

O restante das configurações deve ser mantido como padrão. Esta função reconhece o número total de pixels com sinal e aqueles agrupados juntos na superfície total de pixels com sinal. Além disso, são informados o número de grupos de pixels e o tamanho médio desses grupos.

Compare e selecione a fatia com a maior área total que se ajusta bem. A fatia será marcada. Copie a tabela de dados com a superfície total de alfa sinucleína, o número de inclusões e o tamanho médio das partículas.

Cole os dados em uma planilha do Excel ou anote-os em outro lugar. Retorne ao Fiji. Localize a fatia previamente selecionada no canal da beta tubulina e selecione-a.

Selecione a área do gânglio e clique em analisar. Em seguida, selecione medir. Outra tabela aparecerá mostrando a superfície total do gânglio.

Extraia os dados da tabela para uma planilha do Excel próxima à medição da alfa-sinucleína ou copie-os para outro local usando o Excel. Divida os diferentes parâmetros obtidos na medição da alfa-sinucleína pela superfície do gânglio para obter a superfície total de alfa-sinucleína e o número de inclusões normalizados pelo tamanho do gânglio, a fim de analisar os efeitos da rotenona atuando localmente no sistema nervoso entérico. Cinco miligramas por quilograma do pesticida rotenona foram administrados por gavagem oral a camundongos C57 black six de 1 ano de idade. O cromatograma mostrado aqui revela a presença de um pico de rotenona uma hora após a administração; controles tratados com 20 miligramas por quilograma de rotenona e 5 miligramas por quilograma de rotenona.

Os níveis de rotenona foram determinados em extratos de sangue, cérebro e bulbo raquidiano por CLAE conforme mostrado aqui. A administração de cinco miligramas por quilograma de rotenona por gavagem oral não resulta em níveis mensuráveis no sangue uma, duas ou três horas após o tratamento, conforme determinado por CLAE. Este gráfico mostra os níveis de rotenona no cérebro e no bulbo raquidiano de camundongos tratados.

Uma hora após a administração de 10 miligramas por quilograma ou menos de rotenona, não são detectados níveis de rotenona em amostras de cérebro ou bulbo. Uma hora após a administração, a atividade do complexo mitocondrial I foi avaliada em amostras de músculo e cérebro de camundongos tratados por 1,5 mês. Não há diferença significativa entre os grupos, demonstrando ausência de inibição do complexo mitocondrial I, confirmando assim que não houve rotenona nessas regiões.

Análise do componente dos corpos de Lewy na doença de Parkinson, a alfa-sinucleína, após a administração de rone, permite a determinação confiável da quantidade total de alfa-sinucleína na superfície, da presença de inclusões de alfa-sinucleína e do padrão de alfa-sinucleína na célula. Esta figura mostra marcação com anticorpos anti-tubulina beta três, alfa-sinucleína e DAPI em cortes de duodeno e íleo, conforme pode ser observado aqui. O tratamento por 1,5 mês com roach conhecido induziu um aumento no padrão pontilhado de alfa-sinucleína dentro dos gânglios do sistema nervoso entérico, mesmo em comparação com os controles de três meses.

Esse padrão pode ser observado tanto no íleo quanto no duodeno. Após três meses de tratamento, a formação de inclusões maiores de alfa-sinucleína pode ser vista por meio de coloração imunofluorescente utilizando anti-alfa-sinucleína, o teoflavina e DPI, que demonstram agregação de acúmulos maiores de alfa-sinucleína somente após três meses. Este experimento foi analisado utilizando métodos automatizados de segmentação e limiarização baseada em entropia.

No gráfico à esquerda, cada coluna representa o total de alfa-sinucleína na superfície do gânglio. No gráfico à direita, cada coluna representa o número total de inclusões de alfa-sinucleína por superfície do gânglio analisada. Em conjunto, esses dados sugerem que a administração local de rotenona induz fosforilação, acúmulo e agregação de alfa-sinucleína com gliose nos gânglios do sistema nervoso entérico. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um minuto por animal, se executada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante introduzir a gavagem suavemente, e caso se encontre algum obstáculo, é preferível retirá-la e reintroduzi-la novamente seguindo estes procedimentos. Outros métodos, como CLAE, coloração imuno-histoquímica e análise de imagem, podem ser realizados. Isso permitirá analisar outras regiões, os efeitos da substância ou até mesmo a presença da substância no sangue após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para que neurocientistas investigassem os efeitos de neurotoxinas ambientais no sistema nervoso entérico. Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de aplicar corretamente o gage e analisar as imagens provenientes da imunoquímica. Não se esqueça de que trabalhar com material em decomposição pode ser extremamente perigoso.

Portanto, recomendamos o uso de luvas e máscaras durante a realização deste procedimento.O.