Transfecção única célula em embriões de galinha

O objetivo geral deste procedimento é injetar células individuais de somitos de frango ou tubos neurais com um plasmídeo que codifica a proteína verde fluorescente. Isso é realizado primeiramente puxando pipetas de microinjeção com um diâmetro apropriado da abertura da ponta. O segundo passo do procedimento é preparar um estoque de plasmídeo para as injeções.

O terceiro passo do procedimento é preparar os embriões para a injeção. O quarto passo do procedimento é carregar as micropipetas com DNA plasmidial. O passo final do procedimento é injetar os tecidos desejados.

No final, podem ser obtidos resultados que mostram a variedade de derivados no número de células produzidas por progenitores individualmente marcados em subdomínios escolhidos do somito e do tubo neural por meio de microscopia de imunofluorescência. Olá, sou Rael do Laboratório da Professora Heim do Departamento de Neurobiologia Médica da Universidade Hebraica de Jerusalém. Hoje vamos mostrar um procedimento para injeção em células individuais de somitos e tubos neurais de galinha.

Utilizamos este procedimento no laboratório para estudar a segregação de linhagem de células somáticas e do tubo neural. Então, vamos começar: para gerar células individualmente transfectadas em embriões de galinha, inicie puxando micropipetas. Puxamos nossas pipetas em um puxador de pipetas padrão Naga PP 83 com uma configuração de calor de 13,5.

A configuração precisa deve ser calibrada para obter um diâmetro da ponta da pipeta entre oito e dez mícrons. Utilizamos filamentos contendo tubos de vidro borossilicato com diâmetro externo de um milímetro e diâmetro interno de 0,75 a 0,78 milímetros. Você também pode usar micropipetas comercialmente disponíveis, sem filamento, com diâmetro externo de um milímetro e diâmetro interno de 0,75 milímetros.

Os micropipetas preparados são armazenados em um recipiente de plástico com as pontas protegidas do contato com a borda do recipiente. Para preparar o DNA para microinjeção, o plasmídeo de interesse é transfectado em *E. coli* DH cinco alfa. No dia seguinte, utilizando procedimentos padrão, o plasmídeo é purificado com um kit Maxi prep; para injeções não clonais, utilizamos uma concentração de DNA de um micrograma por microlitro.

Para experimentos em que se desejam clones individuais, a concentração do plasmídeo será muito menor e precisará ser ajustada. Para o P-C-A-G-G-F-P-A, uma concentração de 0,05 a 0,1 micrograma por microlitro funciona bem. Uma vez determinada a concentração ideal, recomendamos a diluição de todo o estoque purificado de plasmídeo em vez de preparações individuais para uma concentração predeterminada.

Este último pode introduzir alguma variação nas taxas de sucesso, provavelmente devido a variações na pureza e em outros parâmetros, como a proporção de plasmídeo em superenrolamento para preparar ovos para microinjeção. Ovos de galinha que foram incubados deitados sobre seus eixos longos até o estágio de desenvolvimento desejado são limpos com etanol a 70% e deixados secar. Em seguida, perfure a extremidade pontiaguda do ovo com tesoura cirúrgica. Utilizando uma seringa de 10 mililitros e uma agulha de 19 gauge, retire dois mililitros de albúmen do ovo e feche os orifícios com parafina quente antes da injeção.

Use uma tesoura cirúrgica para abrir uma janela na parte superior da casca do ovo, evitando que detritos entrem pelo orifício. Coloque um pedaço de fita adesiva sobre a janela e corte um orifício através dela. Para ajudar a visualizar o embrião, utilize uma capilar aquecida montada em um aspirador para injetar uma tinta não tóxica, como a tinta Pelican 17, sob a epiderme blastodérmica.

Em seguida, acesse o embrião cortando e desviando as membranas vitelina e/ou amniótica usando pinos de inseto de 0,14 milímetro montados em um porta-agulhas para carregar o DNA na pipeta puxada Eloqua e adicione uma pequena quantidade de pó verde rápido utilizando o capilar. Aspire uma quantidade mínima de plasmídeo em um capilar de diâmetro adequado até um aspirador. Em seguida, insira-o na extremidade da pipeta oposta à ponta afiada e carregue o DNA o mais próximo possível da extremidade afiada.

Em seguida, acople a pipeta a um injetor manual de pressão de ar montado em um micromanipulador. Aplique uma quantidade mínima de pressão, se necessário, para permitir que a solução do plasmídeo atinja a ponta da pipeta. Posicione a pipeta no meio líquido do ovo enquanto aplica alguma pressão de ar para evitar o entupimento da ponta da pipeta.

Uma vez que o domínio tecidual relevante seja perfurado, a mudança na pressão geralmente é suficiente para liberar o plasmídeo com o verde rápido visível. Se isso não ocorrer, aplique uma leve pressão à seringa até que a mistura de plasmídeo e verde rápido seja ejetada. Repita este procedimento ao longo do eixo do embrião; pode-se adicionar PBS de injeção.

Por fim, feche a janela com fita adesiva e devolva os ovos ao incubador. Evite ventilação e inclua pequenos recipientes com água no incubador para ajudar a manter a umidade e aumentar os rendimentos. Se o local-alvo da injeção estiver superficial o suficiente para ser facilmente visível, como nos somitos dorsais, no tubo neural ou no ectoderma, é possível medir a taxa de sucesso do experimento realizando uma observação em montagem inteira usando um binóculo fluorescente.

Esta etapa é particularmente útil para avaliar se um número excessivo ou insuficiente de células foi marcado. Se for desejável um tempo adicional de incubação, adicione solução de PBS contendo antibióticos ao ovo após a observação e substitua a fita do teto. Além disso, pode-se avaliar a taxa de sucesso da injeção realizando cortes seriados dos embriões e executando imunohistoquímica.

Após quatro horas ou mais, os embriões são fixados e processados para inclusão em parafina. Os cortes montados em lâminas de vidro são então desparafinizados e submetidos à imuno-histoquímica para visualização do marcador; métodos de amplificação, como biotina-estreptavidina, podem ser desejáveis. Por fim, os cortes seriados são analisados para detectar células marcadas nos segmentos injetados.

Se nos ensaios iniciais forem obtidas múltiplas células em vez de células únicas, o estoque de plasmídeo deve ser diluído e o processo repetido até que resultados adequados sejam alcançados. Normalmente realizamos uma única injeção de P-C-A-G-G-F-P por ácaro, visando de seis a 12 segmentos por embrião. Nessas condições, um sinal claro pode ser detectado por observação em montagem inteira, oito horas após a injeção, em pelo menos um segmento de um embrião em cada 10.

Neste exemplo, um embrião foi injetado com um plasmídeo que codifica GFP, e cinco horas depois uma única célula fluorescente é observada em uma visão de montagem inteira do embrião mostrada aqui. Quando observado 24 horas após a injeção no embrião central, um clone de células fluorescentes é visto em um embrião montado inteiramente dois dias após a injeção clonal. O corte histológico deste segmento revela a presença de descendentes clonais na derme e no músculo, demonstrando que progenitores únicos geram ambos os derivados.

No que diz respeito aos somitos, progenitores neuroepiteliais individuais no tubo neural dorsal também podem ser empalados, conforme ilustrado nesta seção transversal, fotografada cinco horas após a injeção aqui. A análise por seções seriadas revelou que transfeções clonais foram obtidas quando a taxa de sucesso era de cerca de 10%. Isso significa que, para alcançar a clonalidade, a técnica é, por definição, altamente ineficiente. Por outro lado, sob essas condições, constatou-se que mais de 93% dos eventos de marcação positiva eram clonais.

Acabamos de mostrar como injetar células únicas de embriões de galinha ao realizar este procedimento. É importante lembrar-se de diluir uma grande quantidade de plasmídeo estoque até uma concentração ideal para infecções em célula única e, em seguida, utilizá-la durante todos os seus experimentos. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.