Expressão, solubilização, detergente e Purificação de um transportador de membrana, as proteínas MexB resistência a múltiplas drogas

Para purificar a proteína de membrana Mex B, primeiro a Mex B é expressa em *E. coli* utilizando métodos de DNA recombinante. Em seguida, as membranas são isoladas e as proteínas de membrana são solubilizadas com um detergente suave. A proteína de membrana solubilizada é purificada por meio de iMac e a proteína é posteriormente purificada por cromatografia de filtração em gel.

O nível de purificação da proteína é determinado utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida SDS. Embora este procedimento possa fornecer informações sobre transportadores transmembranares de resistência múltipla a fármacos, ele também pode ser aplicado a outras proteínas de membrana. Os procedimentos demonstrados hoje serão realizados por um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para este procedimento, Mex B de Pseudomonas aeruginosa será subclonado no vetor de expressão pET-30b(+), de modo que Mex B seja expresso com uma etiqueta de hexahistidina na extremidade C-terminal. Inicie à noite inoculando quatro culturas de 3 mililitros de LB com canamicina com transformantes frescos ou utilize um estoque congelado, cultivando as culturas em rotação a 37 graus Celsius durante a noite. Pela manhã.

Utilize as culturas de crescimento prolongado para inocular 150 mililitros de LB contendo 30 microgramas por mililitro. O Mycin pode cultivar a cultura a 37 graus Celsius em agitador na parte da tarde? Utilize a cultura pequena para inocular seis vezes um litro, dois meios XYT contendo 30 microgramas por mililitro.

Canamicina em frascos de cultivo com suporte para frascos? Utilize 25 mililitros por cultura para uma diluição de 1:40. Incube as culturas a 37 graus Celsius até atingirem uma densidade óptica.

600 de 0,4 a 0,6, cerca de 1,5 horas. Quando as culturas atingirem a densidade adequada, induza a expressão proteica adicionando 0,5 mililitros de IPTG um molar. Coloque todos os frascos novamente no agitador e continue o crescimento a 30 graus Celsius durante a noite, até o recolhimento das bactérias na manhã seguinte.

Retire os cultivos do agitador e resfrie-os. Em seguida, para colher as células, transfira os cultivos para tubos de centrífuga e centrifugue a quatro graus Celsius por 30 minutos a 5.000 rotações por minuto em uma centrífuga de grande escala, enquanto as células estão sendo centrifugadas. Suplemente 100 mililitros de tampão de re-suspensão celular com inibidores de DNAse e lisozima.

Além disso, suplemente dois alíquotas do tampão de suspensão de membrana Resus com inibidores de protease conforme mostrado nesta tabela. Mantenha as três soluções em gelo após a conclusão da centrifugação. Resuspenda os pellets celulares em 100 mililitros de tampão de suspensão celular Resus.

Em seguida, extraia as células. A suspensão celular é carregada na célula de pressão francesa e a célula é colocada na prensa francesa. A pressão é aplicada até atingir 12.000 libras por polegada quadrada.

A válvula é aberta em uma quantidade muito pequena para que as células rompidas saiam gota a gota. É importante não abrir a válvula em excesso, permitindo que as células sejam expelidas em jato, pois serão liberadas com pressão insuficiente e não serão rompidas de forma eficiente. Colete o lisado celular em um frasco mantido frio sobre gelo.

Passe a solução celular novamente por uma célula de pressão francesa a 12.000 libras por polegada quadrada. Transfira o lisado celular para tubos de centrífuga SS 34 e centrifugue para remover os detritos celulares a 10.000 rotações por minuto durante 30 minutos a quatro graus Celsius em um rotor SS 34. O próximo passo é o lisado clarificado.

Utilizado para preparar a fração de membrana. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga ti. 6 4, 7 0,5, centrifugue em um rotor TI 6 4 7 0,5 a 40.000 rotações por minuto durante 50 minutos a quatro graus Celsius.

Descarte o sobrenadante. Use uma pipeta para ressuspender suavemente o pellet, que contém as membranas celulares, em aproximadamente 25 mililitros de tampão de ressuspensão de membrana. Transfira a suspensão de membrana para um tubo de centrífuga limpo e centrifugue em um rotor TI I 6 4 7 0.5 a 40.000 rotações por minuto durante 50 minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, ressuspender o pellet de membrana lavado em 25 mililitros de tampão de ressuspensão de membrana. Em seguida, solubilize as proteínas de membrana nas membranas ressuspensas em cerca de 25 mililitros.

Adicione seis mililitros de DDM a 10% para que a concentração final do detergente seja 2% DDM. Agite a mistura a quatro graus Celsius por duas horas. Após a incubação de duas horas na presença de DDM, centrifugue a mistura a 40.000 rotações por minuto durante 40 minutos a quatro graus Celsius no rotor TI I 6 4 7 0.5, a fim de separar os complexos solúveis de proteína-detergente das proteínas insolúveis. Guarde o sobrenadante que contém os complexos de proteína Mex B com detergente para uso na purificação. Misture o sobrenadante contendo os complexos de proteína Mex B com detergente com dois mililitros das esferas de afinidade metálica em íons equilibradas em Tampão de Suspensão Resus e incube por uma hora em um rolo rotativo a quatro graus Celsius, após a ligação das proteínas à resina.

Despeje a suspensão em um corpo de coluna de fluxo por gravidade e descarte o fluxo inicial. Lave a coluna com 20 mililitros ou 10 volumes de coluna do tampão de ligação e lavagem iMac quando a lavagem da coluna estiver concluída. Elua as proteínas ligadas com 10 mililitros do tampão de eluição iMac.

Retire amostras de 10 microlitros de cada fração de eluição. Misture com 10 microlitros de tampão amostral dois vezes concentrado de SDS e analise em um gel de poliacrilamida a 10%.

Estime a quantidade e a pureza da Mex B em cada fração. Reúna as frações contendo os complexos proteicos de Mex B com detergente e concentre-as em um concentrador centrífugo a quatro graus Celsius. Tenha cuidado para que a proteína não precipite nesta etapa.

Utilize várias centrifugações curtas e observe a precipitação. Após cada centrifugação, prossiga com a purificação das frações reunidas utilizando uma coluna de filtração em gel. Pré-equilibre uma coluna Super Rose 12 HL 30/10 com 24 mililitros de tampão de corrida e aguarde uma linha de base estável.

Em seguida, lave o sistema de carregamento com o tampão em circulação. Antes de aplicar a proteína na coluna, filtre a solução proteica utilizando um filtro de seringa. Em seguida, carregue até 240 microlitros da solução proteica na coluna, contendo proteína com concentração de até cinco miligramas por mililitro.

Execute 1,5 volumes de coluna de tampão e colete frações de 0,25 mililitro. Os complexos proteína-detergente XB eluem como um pico em torno de 10 a 15 mililitros de volume de eluição. Retire amostras de cinco microlitros das frações do pico.

Misture cada amostra em proporção um para um com tampão amostral SDS duas vezes concentrado. Analise as amostras em um gel de poliacrilamida a 10% para estimar a quantidade e a pureza da me Mex B em cada fração; reúna as frações contendo ME B puro. Este gel de poliacrilamida foi carregado com frações coletadas da coluna iMac e frações individuais da coluna de filtração em gel. Após a coluna de filtração em gel, a proteína aparece pura no gel de poliacrilamida corado com kumasi.

Um traço da coluna de filtração em gel mostra o pico principal do complexo proteína-detergente eluindo da coluna. O rendimento médio da proteína mxb é de aproximadamente dois miligramas por seis litros de cultura 2XYT. Uma vez dominado, este procedimento pode ser realizado em oito horas, se for executado corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como expressar, solubilizar e purificar uma proteína de membrana.