Visualização de replicação do DNA mitocondrial em células individuais por Edu amplificação de sinal

O objetivo geral deste procedimento é rotular e visualizar a replicação do DNA mitocondrial em neurônios cultivados. Isso é realizado primeiramente incubando os neurônios com o análogo da timidina EDU por duas a 24 horas. O segundo passo do procedimento consiste em marcar o EDU que contém um grupo alquino com o verde orgânico fluorescente 488 azida por meio de uma reação covalente catalisada por cobre.

O passo final do procedimento é amplificar o sinal orgon green com uma etapa de amplificação de sinal por aramida, a fim de visualizar o EDU que foi incorporado ao DNA mitocondrial recém-sintetizado. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram a replicação do DNA mitocondrial em compartimentos subcelulares específicos de neurônios, por meio da combinação da química click do EDU e da subsequente amplificação de sinal por tear mind. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como a marcação com BRDU, é que a marcação com EDU é mais fácil e mais suave, permitindo a realização adicional de coloração imunofluorescente para marcadores neuronais.

Este método pode responder perguntas fundamentais sobre a regulação do número de mitocôndrias, como, por exemplo, como os neurônios atendem às demandas energéticas variáveis em seus compartimentos subcelulares, incluindo corpos celulares, axônios, dendritos e terminais sinápticos. Assim, este método pode fornecer informações sobre os mecanismos subjacentes à patogênese de diversas doenças neurológicas mitocondriais, incluindo neuropatias e neurodegeneração. Mas, de forma importante, ele também pode ser aplicado a outros sistemas nos quais alterações no número de cópias do DNA mitocondrial provavelmente subjazem à patogênese do estado patológico, incluindo toxicidade medicamentosa, câncer e envelhecimento.

Este vídeo demonstrará como marcar o DNA mitocondrial recém-sintetizado, abreviado como M-T-D-N-A, em neurônios de gânglios da raiz dorsal cultivados sobre lamínulas de vidro estéreis de 12 milímetros. Em uma placa de cultura de 24 poços, dilua o estoque de 10 milimolar de cinco etanol dois doxi uridina, abreviado EDU do kit de ensaio Clicka EDO Microplate, na proporção de 1 para 100 no meio de cultura, obtendo um estoque de 10 XEDU. O estoque de 10 XEDU é então adicionado diretamente ao meio em cada poço; incube os neurônios tratados por duas a 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma câmara de segurança.

Fixe os neurônios em paraformaldeído 2% por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente. Lave duas vezes em PBS 1X por dois a cinco minutos em cada lavagem. Os neurônios fixados podem ser armazenados em PBS 1X fresco a quatro graus Celsius por até um mês.

Prepare uma câmara úmida conforme descrito no texto acompanhante. Use pinças de ponta fina para transferir 28 lamínulas fixadas, incluindo controles positivos e negativos de EDU, para folhas de paraforma hidrofóbica dentro da câmara úmida. Adicione novamente 200 a 300 microlitros de um XPBS para cobrir a superfície de cada lamínula.

Prepare o kit de ensaio click it conforme descrito no texto e nas instruções do fabricante para marcar o DNA mitocondrial em 75 a 80 microlitros de uma solução permeabilizante contendo 0,1% de Triton X em PBS 1X para cada lamínula, cubra e incube em temperatura ambiente por 10 minutos. Use uma pipeta de bulbo com ponteira de 200 microlitros fixada na extremidade para remover suavemente o líquido sem perder as células.

Use uma pipeta com bolha para inundar suavemente a lamínula. Lave com 200 a 300 microlitros de um XPBS para remover completamente a solução anterior. Lave cada lamínula duas vezes.

Pipete de 75 a 80 microlitros de peróxido de hidrogênio fresco a 1% em um XPBS sobre cada lamínula. Incube coberto por 30 minutos à temperatura ambiente para inibir a atividade de peroxidase endógena. Enxágue duas vezes com um XPBS como antes, preparando recentemente o coquetel de reação de clique conforme detalhado no texto acompanhante.

Pipete para cima e para baixo para misturar. Não vortexar os neurônios com 75 a 80 microlitros de fixador click at EDU por lamínula; incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Durante a incubação de pós-fixação, diluir o coquetel de reação com um volume igual de fixador clicka EDU.

Adicione o coquetel de reação a cada lamínula para proteger da luz e incube em temperatura ambiente por 25 minutos. Remova cuidadosamente o coquetel de reação e lave duas vezes com tampão bloqueador diluído a uma vez sob um microscópio epifluorescente. Verifique a coloração verde orgon nos núcleos quando a coloração de EDU estiver completa.

Inicie a amplificação do sinal de cupim ou TSA adicionando solução bloqueadora de TSA a 1% a cada lamínula e incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Gire brevemente por centrifugação o anticorpo estoque conjugado com peroxidase de rábano-picante verde antione preparado de duas a 24 horas antes do TSA, dilua o anticorpo primário na proporção de 1:300 na solução bloqueadora de TSA e inverta ou pipete para misturar bem no vórtex. Adicione 75 microlitros a cada lamínula e incube a quatro graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, lave três vezes com um XPBS à temperatura ambiente. Incube as lamínulas na lavagem final por um período adicional de 30 a 60 minutos para garantir a remoção do anticorpo primário não ligado. Prepare a reação IDE de acordo com a parte textual deste protocolo imediatamente antes do uso.

Incube as lamínulas com a reação IDE por 15 minutos à temperatura ambiente. Lave três vezes com um XPBS, incubando na lavagem final por 30 a 60 minutos, como antes, sob o microscópio. Verifique a marcação de DNA mitocondrial e monte neurônios corados com sucesso em lâminas de vidro com um meio de montagem ANTIFA contendo DPI; as imagens apresentadas aqui são imagens representativas de contraste de interferência diferencial de neurônios do gânglio da raiz dorsal embrionários e adultos, que são tipicamente utilizados para análise.

Esses diagramas esquemáticos representam o procedimento para marcação de EDU no ADN mitocondrial com um sinal fluorescente verde. Células de neuroblastoma F11 mitoticamente ativas servem como controle positivo e ilustram o padrão de marcação do EDU que foi incorporado ao DNA nuclear e mitocondrial nessas imagens representativas de fluorescência sobrepostas ao campo claro. Os sinais verdes pontuados mostram o sinal amplificado de EDU incorporado ao ADN-M-D-N-A recém-sintetizado de neurônios do gânglio da raiz dorsal tanto embrionários quanto adultos.

O procedimento de marcação com EDU permite a subsequente coloração imunofluorescente de marcadores neuronais, como neurofilamento, em vermelho. Esses diagramas esquemáticos representam o procedimento para marcação de EDU e MTD NA com um sinal fluorescente vermelho. Células de neuroblastoma F 11 com atividade mitótica ativa servem como controle positivo e ilustram o padrão de marcação do EDU incorporado ao DNA nuclear e mitocondrial.

Este diagrama esquemático representa o procedimento para marcação de BRDU no M-T-D-N-A recém-sintetizado com um sinal fluorescente verde ou vermelho. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de incluir controles utilizando células mitoticamente ativas, a fim de verificar a marcação bem-sucedida de EDU e os núcleos celulares antes de prosseguir para as etapas de amplificação para visualizar a marcação do DNA mitocondrial após este procedimento. Outros métodos, como a imunofluorescência padrão, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a forma como a síntese do DNA mitocondrial é regulada em subpopulações específicas de neurônios ou compartimentos neuronais. Devido ao seu desenvolvimento, esta técnica abrirá caminho para pesquisadores na área de neurobiologia explorarem a regulação do número de mitocôndrias em modelos culturais de fisiologia normal, bem como em modelos culturais que simulam doenças comprometidas.

Estados neurológicos.