Preparação de rato Imunogénio Pituitária para a indução de hipofisite Auto-Imune Experimental

A hipofisite autoimune caracteriza-se pelo aumento do tamanho da glândula pituitária e por uma deficiência em um ou mais hormônios hipofisários. Os autoantígenos responsáveis permanecem desconhecidos. Aqui, demonstra-se um protocolo para o preparo de proteínas da glândula pituitária de camundongo para uso no estudo desta doença.

Primeiramente, as glândulas pituitárias são isoladas de camundongos eutanasiados. As pituitárias são então homogenizadas para romper mecanicamente as células e liberar proteínas citosólicas. O homogenato é clarificado por centrifugação de baixa velocidade e avaliado quanto à quantidade por ensaio colorimétrico, BCA, e quanto à qualidade por eletroforese em gel de poliacrilamida.

Por fim, o homogeneizado proteico aquoso é misturado com um adjuvante oleoso. Essa mistura é então injetada em camundongos para criar um modelo de camundongo que assemelha a hipofisite autoimune. Conforme mostrado no vídeo complementar, quatro técnicas foram descritas para induzir hipofisite em animais experimentais.

A técnica apresentada neste artigo, que consiste na injeção de uma mistura de proteínas hipofisárias com adjuvante de gripe, é a mais antiga, remontando aos anos 1960. Outras abordagens incluíram a injeção de glicoproteínas solúveis do vírus da rubéola em 1992, a injeção estereotáxica de um adenovírus diretamente na glândula hipófise em 2002 e o transplante da glândula hipófise de uma linhagem de rato para a cápsula renal de outra linhagem de rato em 2010. A principal vantagem da abordagem com adjuvante de Florence é que, atualmente, ela é menos invasiva, mais consistente e, acima de tudo, mais precisa na indução de uma doença que se assemelha estreitamente à forma humana.

Embora relatada desde a década de 1960, a técnica com adjuvante estrangeiro apresentou baixo desempenho na indução de hipofisite. Quando iniciei meu trabalho de doutorado, conseguia obter apenas casos e gravidade modestos de hipofisite utilizando o protocolo publicado com adjuvante estrangeiro. As coisas melhoraram significativamente quando tive a ideia de aumentar dez vezes a quantidade de proteínas de pituitária contidas na emulsão EM.

Embora este método possa fornecer informações sobre a patogênese da hipofisite autoimune, ele também pode ser utilizado para estudar outras doenças autoimunes cujos autoantígenos ainda permanecem por ser identificados. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades principalmente com o último passo, o preparo da emulsão, porque exige habilidades manuais, tempo e dedicação. A demonstração visual é, portanto, essencial para compreender como uma emulsão adequada deve ser preparada.

A implicação desta técnica vai além do campo da autoimunidade. Saber como preparar o antígeno para imunização também pode ser utilizado na produção de anticorpos monoclonais ou para testar novas vacinas. Esta técnica será demonstrada por S. Zoo Heróico Ura e Mayland al Gato do meu laboratório.

A hipófise do camundongo é uma glândula com formato cilíndrico que se localiza na base do crânio, numa depressão do osso esfenóide denominada fossa pituitária. A glândula é delimitada lateralmente pelos nervos trigêmeos e anteriormente pelo quiasma do nervo óptico. É composta por um lobo anterior maior e por lobos intermediário e posterior menores.

Para isolar a glândula pituitária, use uma tesoura para decapitar o camundongo eutanasiado, em seguida faça cortes paralelos de trás para frente do crânio. Levante o cérebro e vire-o para trás para expor a glândula pituitária, que se apresenta como um cilindro no contexto de um triângulo isósceles. Tendo a glândula pituitária como base, os nervos trigêmeos como lados e o quiasma óptico como vértice.

Circule a glândula com as pontas de pinças fechadas para romper as meninges ao redor. Em seguida, usando pinças finas, segure a hipófise da fossa da turca e coloque-a em um tubo plástico sobre gelo seco. Para um único preparo, colete 300 glândulas hipofisárias de camundongo.

Esta coleta exige aproximadamente nove horas de trabalho. Após a conclusão da coleta, armazene as glândulas pituitárias a menos 80 graus Celsius até que sejam necessárias. Coloque um tubo Falcon de 15 mililitros em banho de gelo.

Adicione ao tubo 250 microlitros de tampão de homogeneização. Para cada 100 hipófises coletadas logo antes da homogeneização, adicione as glândulas hipofisárias de camundongo ao tampão. Em seguida, posicione a ponteira do homogeneizador de politron, com gerador de cinco milímetros de diâmetro, no fundo do tubo de Falcon contendo as hipófises de camundongo e o tampão, e homogeneíze na velocidade máxima por 30 segundos.

Movimente suavemente o tubo para cima e para baixo, mantendo-o em gelo. Em seguida, deixe o homogenato em gelo por um minuto. Repita as etapas de homogeneização e resfriamento mais duas vezes.

Essa homogeneização suave deve romper as células e liberar as proteínas sem quebrar os núcleos. Centrifugue o homogeneizado em baixa velocidade, cerca de 1000 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius, para sedimentar os núcleos, tecido não rompido e materiais insolúveis, como tecido conjuntivo e complexos de proteínas desnaturadas, tomando cuidado para não perturbar o pellet.

Transfira o SNA agora chamado sobrenadante pós-nuclear ou PNS para um novo tubo Falcon. Mantenha o PNS no gelo, recupere o pellet usando o mesmo volume de tampão de homogeneização usado anteriormente, homogeneíze e centrifugue como antes. Após reunir as duas amostras de PNS, alíquota a solução em diversos tubos de microcentrífuga.

Armazene os tubos de microcentrífuga a menos 80 graus Celsius até que sejam necessários. Este preparo proteico é estável a menos 80 graus Celsius, mas perde gradualmente sua potência. Assim, recomenda-se utilizá-lo dentro de seis meses a partir da preparação.

Retenha uma pequena alíquota do SNT para determinar o rendimento e a concentração de proteína pelo ensaio do ácido bicínquiconílico. Em seguida, determine a qualidade da proteína por eletroforese em gel a partir de 300 glândulas hipofisárias de camundongo, com peso total médio de aproximadamente 570 miligramas. Espere um rendimento de 60 miligramas de proteínas hipofisárias ou um miligrama de proteína para cada 10 miligramas de tecido.

A concentração da proteína é tipicamente de cerca de 40 miligramas por mililitro. O exemplo fornecido aqui é para imunizar 10 camundongos. Planeje injetar em cada camundongo 100 microlitros de emulsão contendo um miligrama de proteína de hipófise, considerando dois camundongos extras para perdas de material durante o preparo; assim, preparam-se 12 miligramas de emulsão proteica.

Inicie o procedimento descongelando rapidamente as alíquotas proteicas congeladas aquecendo-as com as mãos. Ajuste a concentração proteica para 20 miligramas por mililitro com PBS. Em seguida, aspire 600 microlitros do extrato proteico hipofisário correspondente a 12 miligramas em uma seringa Gas Tite Hamilton de 2,5 mililitros e ressuspenda o adjuvante FRONS completo ou CFA contendo cinco miligramas por mililitro de Mycobacterium tuberculosis inativado pelo calor, agitando manualmente.

Em seguida, aspire 600 microlitros da CFA para outra seringa Hamilton de 2,5 mililitros. Acople e fixe uma agulha microemulsificante de 22 gauge à seringa cheia de CFA. Empurre lentamente o êmbolo de modo que a agulha seja preenchida com CFA.

Em seguida, conecte e fixe a outra extremidade da agulha à outra seringa preenchida com extrato proteico de hipófise. Evite aprisionar bolhas de ar dentro das seringas. Avance lentamente o êmbolo da seringa de CFA para empurrar o componente oleoso para dentro do extrato hipofisário aquoso, de modo que apenas uma pequena quantidade seja misturada.

Em seguida, empurre o êmbolo da seringa com o extrato de hipófise para dentro da seringa com CFA. Repita este procedimento aumentando gradualmente a quantidade de material misturado até que todo o conteúdo esteja homogeneizado. Esse material esbranquiçado e uniformemente distribuído representa a emulsão de água e óleo.

Uma vez formada a emulsão, repita o ciclo completo de vai e vem pelo menos 500 vezes. Após o ciclo final, as seringas conterão uma emulsão de água e óleo na proporção um para um, na qual a concentração da proteína hipofisária agora é de 10 miligramas por mililitro. A emulsão está pronta para uso; para testar a qualidade da emulsão, coloque uma gota dela em um béquer com água. Se a emulsão foi preparada corretamente, a gota permanecerá compacta e firme na superfície.

Se a emulsão apresentar baixa qualidade, ela se espalhará e se dividirá em gotículas menores. A emulsão é injetada no mesmo dia de sua preparação em camundongos SJL para induzir hipofisite autoimune experimental. Este protocolo é detalhado no joVE vertical acompanhante.

Uma vez que a glândula pituitária tenha sido coletada e as técnicas dominadas, pode-se realizar a instrução proteica em uma hora, lembrando de trabalhar rapidamente e sobre gelo. Durante esta etapa, durante a preparação da imersão, o que requer aproximadamente uma hora. Lembre-se de trabalhar lentamente e com paciência na fase inicial de mistura após o seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de autoimunidade explorassem os mecanismos pelos quais linfócitos autorreativos reconhecem e infiltrem o órgão-alvo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar um extrato proteico da glândula pituitária de camundongo e de como misturá-lo com adjuvantes de Freund completos para preparar uma emulsão pronta para ser usada como imunógeno. Não se esqueça de que trabalhar com seringas e adjuvantes de Freund completos, que contêm micobactérias de tuberculose inativadas e secas, pode ser perigoso caso você se fure acidentalmente.

Portanto, utilize sempre luvas descartáveis e descarte as agulhas adequadamente ao realizar este procedimento.