Em Quantificação in vivo de proteínas G Interações Receptor Acoplado usando espectral Resolvido Microscopia de dois fótons

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar informações estequiométricas e estruturais sobre uma proteína. Todos os complexos de ligantes que expressam células biológicas vivas, células de levedura são geneticamente modificadas para expressar as proteínas de interesse ligadas a uma sonda fluorescente doadora ou a uma sonda fluorescente aceitadora. As sondas doadoras podem ser excitadas diretamente por um laser.

Embora os aceptores possam ser excitados apenas por meio da transferência de energia proveniente de um dador próximo excitado, as células são expostas à luz de um laser pulsado de infravermelho próximo. A fluorescência emitida pelos sondas é separada em seus componentes espectrais por uma grade de transmissão e projetada na superfície de uma matriz CCD com multiplicação de elétrons. Assim, espectros fluorescentes completos de ligantes individuais são obtidos para cada posição na amostra.

O perfil espectral da fluorescência detectada depende da interação específica das proteínas de interesse. Os dados são analisados para determinar, em cada pixel da imagem de uma célula escaneada, as emissões separadas das sondas doadoras e aceptoras. A eficiência da transferência de energia é determinada em cada pixel da imagem, e então os pixels são agrupados de acordo com sua eficiência de FRET e histograma.

A interpretação do histograma permite a determinação in vivo da proteína, tamanho e configuração do complexo. Olá, meu nome é Michael Stoneman do Grupo de Pesquisa Riku da Universidade de Wisconsin Milwaukee. Meu nome é Singh.

Sou do Laboratório Rikus em Milwaukee, Wisconsin. A principal vantagem desta técnica é que os perfis completos de emissão de centenas de complexos de ligantes dentro de uma célula são obtidos com um único e completo varredura da célula. Normalmente, a maioria dos métodos de microscopia de fluorescência exige que a célula de interesse seja varrida múltiplas vezes para acumular informações espectrais suficientes a fim de determinar a eficiência de fret em várias regiões de interesse dentro da célula.

No entanto, reações bioquímicas por difusão podem alterar a composição molecular dessas regiões de interesse e, com isso, limitar as informações obtidas na varredura da imagem. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no estudo de proteínas e interações proteicas em células vivas, como qual é o tamanho dos oligômeros prejudiciais? Em que estágio do ciclo de vida da proteína os oligômeros se formam, e qual é o papel do oligômero dessa proteína na função celular?

O microscópio de duas fótons com resolução espectral acumula informações espectrais sobre os complexos olímpicos na célula da imagem ao escanear o foco do feixe de excitação por meio da amostra de interesse em diversos pontos. Um par de espelhos de escaneamento ortogonais é utilizado para deslocar o foco do feixe a laser pela amostra em duas direções diferentes. O movimento dos espelhos de escaneamento é controlado por computador e sincronizado com a extração de dados de intensidade de fluorescência da câmera CCD; a partir dos perfis lineares de intensidade de fluorescência, mapas espaciais correspondentes a um determinado comprimento de onda da luz podem ser reconstruídos.

Para reconstruir com precisão mapas espaciais de intensidade fluorescente de raios X e calcular o comprimento de onda real correspondente a cada um desses mapas, o protocolo de varredura em linha deve ser calibrado utilizando uma solução de fluoresceína. Para iniciar o procedimento de calibração, envie ao espectro de excitação em um comprimento de onda de 800 nanômetros, que é duas vezes o comprimento de onda máximo de excitação da marcação doadora GFP dois dois para enviar ao espectro de excitação, traduza o prisma localizado dentro da cavidade a laser para modificar a dispersão da velocidade do grupo usando o programa de computador ao qual a câmera está conectada. Envie um comando ao chip CCD para reduzir a temperatura do chip CCD até sua temperatura mais baixa alcançável.

Para reduzir o ruído escuro, pipete 10 microlitros de solução de fluoresceína sobre uma lâmina de microscópio e cubra com uma lamínula, de modo que uma camada fina da amostra seja uniformemente dispersa na região entre a lamínula e a lâmina de microscópio. Coloque uma pequena gota de óleo de imersão sobre a superfície da lamínula. Em seguida, fixe a lâmina de microscópio na platina de translação XY, Z e movimente a lâmina e a platina na direção do eixo óptico. Ajustando manualmente o atuador linear, desloque a lâmina até que a objetiva do microscópio entre em contato com a gota de óleo de imersão. Altere a câmera para um modo de aquisição de dados em vídeo, de modo que a luz admitida que atinge o arranjo CCD seja exibida na tela do computador em tempo real.

Desligue todas as luzes ambiente do ambiente para reduzir o ruído de fundo detectado no arranjo CCD. Ajuste lentamente o micrômetro que controla a platina de translação na direção do eixo óptico para posicionar a amostra no ponto focal do feixe a laser. Quando a amostra de fluoresceína estiver em foco, a emissão aparecerá como uma linha nítida no arranjo CCD.

Baixe a leitura das intensidades dos pixels do arranjo CCD para o computador. Meça a intensidade dos pixels em função da posição no arranjo CCD abrindo a matriz de valores de intensidade baixada no ImageJ e traçando uma linha através da região fluorescente. Utilize o comando image day.

Analise o perfil do gráfico para criar um gráfico que ilustre o espectro de emissão da amostra de fluoresceína. Ajuste o parâmetro incremental do espelho, que controla o movimento do laser. Foque na direção Y, de modo que posições Y adjacentes dentro da amostra resultem no deslocamento do pico dos espectros fluorescentes exatamente um pixel ao longo da dimensão espectral no arranjo CCD.

Para monitorar isso, faça o download da intensidade dos espectros de fluoresceína em duas posições Y diferentes na amostra. Em seguida, abra as imagens de intensidade com o ImageJ e localize a posição do píxel de pico para cada um dos espectros fluorescentes. Usando o cursor do ImageJ, mantendo o obturador do CCD aberto, varra o foco do laser ao longo da amostra na direção X.

A luz emitida por cada vóxel ao longo da linha do varredura deve incidir sobre a matriz CCD no final de cada varredura de linha; armazene os dados obtidos da matriz CCD para esta varredura de linha e, em seguida, limpe os pixels da matriz CCD. Mova a posição do laser. Foque na direção Y pela quantidade determinada anteriormente.

Em seguida, varra o feixe de laser na direção X ao longo da amostra. Mais uma vez, mantendo o obturador do CCD aberto, armazene os dados. Repita este procedimento de varredura em linha até que uma área física cerca de 50% maior que as dimensões de uma única célula biológica tenha sido iluminada pela luz do laser.

A relação entre o número da linha de uma imagem específica de varredura linear e o comprimento de onda deve ser utilizada para reconstruir as imagens e obter múltiplos mapas faciais de intensidades fluorescentes em diferentes comprimentos de onda. Para obter a imagem de emissão fluorescente para um comprimento de onda específico, localize o número da linha na imagem obtida a partir da primeira varredura linear que corresponde a esse comprimento de onda. Em seguida, a linha adjacente da imagem de varredura linear subsequente corresponde à próxima linha da imagem de emissão fluorescente.

Para esse comprimento de onda específico, agrupe todas as linhas de imagem que correspondem a este comprimento de onda para obter os mapas espaciais de intensidade fluorescente XY da amostra nesse comprimento de onda. Repita este procedimento para todos os outros comprimentos de onda obtíveis para coletar dados sobre suas amostras. Primeiro, remova do incubador as placas com colônias de levedura transformadas.

Deve haver pelo menos três tipos de células transformadas. Células que expressam as proteínas de interesse marcadas com os dois tipos de sondas fluorescentes. Células que expressam apenas proteínas marcadas com as sondas fluorescentes doadoras e células que expressam apenas proteínas marcadas com as sondas fluorescentes aceptoras.

Adicione 100 microlitros de cloreto de potássio 100 milimolar a um tubo de microcentrífuga. Em seguida, utilizando uma ponteira de micropipeta, raspe três a cinco colônias de levedura da placa de células que expressam proteínas marcadas com doador e exceto sondas fluorescentes e inocule o cloreto de potássio 100 milimolar. Com essas células, retire 10 microlitros da suspensão celular e dispense sobre uma lâmina de microscópio nova.

Cubra a gota com uma lamínula e coloque uma gota de óleo sobre a superfície da lamínula. Em seguida, feche manualmente o obturador no trajeto do feixe a laser para bloquear a luz do laser de atingir a objetiva do microscópio. Prenda a lâmina de microscopia ao estágio de translação XY, Z e mova o estágio da lâmina na direção do eixo óptico até que a objetiva do microscópio entre em contato com a gota de óleo de imersão.

Agora ligue a iluminação de campo amplo e vá até a câmera. Modo de vídeo de coleta de dados. A imagem de campo amplo da amostra estará severamente desfocada devido à presença da grade de transmissão no caminho de emissão.

Portanto, coloque um filtro de passagem de banda com uma largura total em meia altura pequena no trajeto óptico anterior à grade de transmissão. Translade lentamente a fase de translação na direção do eixo óptico enquanto observa a imagem das células na tela da câmera até que as células entrem em foco. Translade a fase em qualquer uma das direções X ou Y para trazer uma única célula até a localização do foco do feixe laser.

Desligue a fonte de iluminação de campo amplo e remova o filtro de caminho de banda do percurso de emissão. Desbloqueie o feixe de laser por um curto período enquanto simultaneamente observa o sinal recebido no arranjo CCD. Se um sinal fluorescente for detectado no arranjo CCD durante o tempo em que o feixe de laser incide sobre a célula, realize então uma varredura completa de aquisição de dados fluorescentes dessa célula.

É fundamental utilizar os mesmos parâmetros de varredura, especificamente o número de linhas e o incremento em y determinados no procedimento de calibração demonstrado anteriormente. Repita o processo de localização celular e aquisição de dados de fluorescência para um grande número de células que expressam proteínas ligadas tanto às marcas doadoras quanto às marcas aceptoras. Após acumular imagens de fluorescência suficientes de células que expressam proteínas marcadas com ambas as marcas, repita todo o processo para células que expressam apenas proteínas marcadas com as sondas fluorescentes doadoras e para células que expressam apenas proteínas marcadas com as sondas fluorescentes aceptoras.

Por fim, reconstrua todos os escaneamentos para obter mapas espaciais de intensidade fluorescente XY resolvidos espectralmente para cada conjunto de dados, utilizando o procedimento descrito anteriormente. As três figuras ilustram os mapas espaciais resultantes calculados a partir de medições de microscopia de dois fótons resolvidas espectralmente realizadas em uma célula de levedura que expressa o receptor estéril para o fator alfa. Mapas bidimensionais dos sinais do doador e do aceptor foram obtidos mediante a análise dos perfis de emissão espectral obtidos em cada localização da célula.

As intensidades de fluorescência são atribuídas cores falsas de acordo com seus valores, e a escala é mostrada como uma inserção. Um mapa bidimensional das eficiências aparentes de FRET foi então calculado usando as imagens KDA e KAD, com base nos valores extraídos do mapa de eficiências aparentes de FRET da célula; em seguida, foi preparado um gráfico de histograma. Os valores medidos de EAPP da célula são representados por círculos.

A linha sólida vermelha representa o melhor ajuste aos dados medidos usando a soma das funções individuais de cálcio representadas por linhas verdes sólidas. A análise do histograma, descrita no texto do protocolo, confirma que o complexo estéril do receptor de fator alfa dois com todos os ligantes assume a forma de um tetrâmero com formato RBA in vivo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 12 horas se for executada corretamente.

Ao realizar este experimento, é importante manter baixa a potência da fonte de excitação. É fundamental evitar a excitação múltipla do doador por um único pulso.