Agar-Microcosmos Bloco de decomposição controlada de Tecidos Vegetais por fungos aeróbicos

O objetivo geral deste procedimento é inocular um fungo aeróbico degradador de madeira em um microcosmo de placa de Petri no qual a umidade da madeira e os substratos exógenos são rigorosamente controlados. Isso é realizado primeiramente preparando microcosmos com volumes exatos de meios conhecidos. Em seguida, a madeira a ser degradada, bem como quaisquer substratos sólidos exógenos, são montados sobre uma grade plástica na superfície do ágar, sem permitir contato entre os substratos.

O microcosmo é então inoculado e incubado com o fungo teste. Após a incubação, os blocos de madeira são coletados para determinar a perda de massa e para preparar os tecidos para análises. Em última instância, podem ser obtidos resultados que demonstram o grau de biodeterioração da madeira e o papel das fontes exógenas de elementos por meio de medidas de perda de massa, observações da morfologia micelial e análises elementares direcionadas, como espectroscopia de plasma acoplado indutivamente.

Olá, meu nome é Brooke Jacobson do laboratório do Dr. Jonathan Schilling do Departamento de Engenharia de Bioprodutos e Biotecnologia do sistema da Universidade de Minnesota. Hoje vamos mostrar um procedimento para usar placas de Petri como microambientes para a decomposição de tecidos vegetais por fungos aeróbicos. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os mecanismos de decomposição de lignocelulose por fungos.

A lignocelulose é o tecido vegetal composto por lignina, celulose e hemicelulose. O tecido que estudamos com maior frequência é a madeira; erros com os aspectos menos técnicos do design do bloco de rosca são as causas mais comuns de falha e as principais fontes de variabilidade entre estudos, tornando a publicação em vídeo da nossa montagem do bloco de rosca algo útil. Sabemos por experiência que este procedimento produz resultados de alta qualidade e baixa variabilidade.

Então vamos começar. Para esses experimentos, utilize placas de Petri que tenham um centímetro a mais de profundidade do que as placas de Petri típicas, para aumentar o espaço livre acima do bloco de madeira no microcosmo.

Inicie a preparação do microcosmo preparando quantidade suficiente de meio para 20 mililitros por placa de Petri, livre de cálcio e ferro. Pese 15 gramas de ágar e adicione a um balão volumétrico de 500 mililitros contendo aproximadamente 400 mililitros de água deionizada enriquecida com suplementos. Utilize soluções estoque previamente preparadas para adicionar micronutrientes à mistura.

Após a adição dos nutrientes, complete o balão volumétrico até a marca de 500 mililitros. Em seguida, transfira o meio para um balão de 1000 mililitros. Autoclave a 121 graus Celsius e 16 PSI por 20 minutos.

Tenha cuidado para não exceder um volume de 500 mililitros por frasco, a fim de evitar que o ágar solidifique antes que as placas de teste sejam preparadas. Após a autoclavação, deixe o meio esfriar ao toque para minimizar a condensação. Minimizar a umidade é essencial nestes experimentos, pois o teor de umidade ou mc.

Acima de 80% causará anoxia nos tecidos. Limite a decomposição por fungos aeróbicos e aumente a variabilidade uma vez. Resfrie. Use uma pipeta portátil com auxílio e pipetas estéreis de poliestireno de 10 mililitros para realizar o processo assépticamente.

Transfira o ágar para uma pilha alta de placas dentro de uma cabine de segurança biológica. Em seguida, corte generosamente grades de malha plástica para que se encaixem no interior das bases das placas. Após o corte e uma lavagem completa das grades com sabão e água, prepare as grades de malha para secagem e autoclavagem para esta demonstração.

O pinheiro amarelo do sul ou SYP é utilizado porque representa uma fonte importante de madeira serrada. Em construções residenciais nos EUA, use madeira não tratada e corte blocos livres de nós de 19 por 19 milímetros a partir de um único corte longitudinal no sentido das fibras. Corte esse comprimento em blocos cúbicos de 19 milímetros.

Divida os blocos de 19 milímetros cúbicos ao meio, no sentido do veio, usando cinzel e martelo em vez de serra. Isso cria uma borda irregular do bloco voltada para baixo sobre a malha plástica no microcosmo do bloco agroflorestal e uma borda superior lisa para rotulagem. Rotule a borda lisa dos blocos com um lápis, corte blocos suficientes para atender aos tratamentos, bem como aos controles não inoculados, que servirão tanto como monitores de contaminação quanto como amostras de dados de linha de base condicionadas em paralelo com material secado em estufa. Coloque as amostras em bandejas de alumínio para soro de leite e em uma estufa de convecção a 100 graus Celsius por 48 horas.

Transfira as amostras do forno para um dessecador para resfriá-las uma vez. Resfrie. Pese previamente as amostras para determinar o peso seco inicial no forno. Finalmente, prepare as amostras, incluindo grades de plástico e madeira, para autoclave envolvendo-as firmemente com papel alumínio para minimizar a umidificação.

Isso não exige que cada amostra seja embrulhada individualmente, mas que a exposição ao vapor seja baixa e constante. Autoclave as amostras identificadas a 121 graus Celsius e 16 PSI por uma hora. Em uma cabine de segurança biológica estéril, monte AE vazios, uma placa fonte para inóculo, malha, substrato vegetal, materiais exógenos, caneta Sharpie, tiras de paraform, pinças e ferramentas de transferência.

O próximo passo da inoculação é adicionar os itens ao ágar, mantendo as placas de Petri fechadas para minimizar o risco de contaminação. Flameje as ferramentas de transferência e as pinças com etanol a 95% conforme forem sendo utilizadas. Primeiro, adicione a malha plástica à placa de Petri.

Em seguida, adicione o substrato de madeira aqui. Dois blocos de madeira são colocados ao longo do comprimento da malha para que os dados possam ser emparelhados entre as colheitas iniciais e tardias. Esses blocos são colocados lado a lado, com a veia da madeira voltada para o ponto de origem do inóculo fúngico.

Em seguida, adicione os materiais exógenos aqui. O papel do gesso está sendo testado na degradação por um fungo filamentoso. Portanto, o fungo deve encontrar esses discos de gesso antes de atingir a madeira.

Um disco de gesso é adicionado entre cada bloco e o ponto de inóculo na parte superior da malha. Tenha cuidado para evitar o contato entre os discos na madeira, mantendo-os próximos uns dos outros. Para o inóculo fúngico, utilize um saca-rolhas número quatro com diâmetro de sete milímetros para obter cilindros a partir de culturas de duas semanas crescidas em 20 mililitros de ágar.

Isso ajuda a controlar o volume do inóculo. Para os controles não inoculados, o ideal é adicionar um fragmento de uma placa estéril. Não permita o contato entre o inóculo e os substratos exógenos ou a madeira, mas posicione-os próximos uns dos outros.

Use um disco de inóculo por bloco. Sobreponha as placas com parafina cortada com uma lâmina, mantenha as placas na posição horizontal e enrole a parafina em um movimento suave e contínuo. Por fim, identifique as tampas das placas usando uma caneta resistente ao álcool, rotulando os números dos blocos diretamente sobre os respectivos substratos.

Também desenhe círculos sobre os discos de gesso. Transfira as placas cuidadosamente para uma incubadora biológica para evitar movimentação do conteúdo e minimizar a condensação devido a flutuações de temperatura. As condições utilizadas aqui são de 20 graus Celsius e no escuro, realizando colheitas em série temporal de forma asséptica, exceto pela última colheita.

No ponto de colheita da semana cinco, remova todo o lote tratado. Pulverize cada parte inferior e superior com etanol 70% e use pinças flamejadas para remover o material dentro do gabinete de biossegurança. Tire fotos antes de destruir as placas de agri, focando em qualquer morfótipo F ou melão.

Em seguida, remova os blocos a serem tratados. Remova qualquer excesso de fago, mas tenha cuidado para não perder nenhum material em decomposição no forno. Seque os blocos em bandejas de alumínio e determine a perda de massa utilizando os pesos fresco e seco dos controles para monitorar a ocorrência de absorção excessiva.

Os dados de perda de massa ajudam a avaliar o progresso da decomposição e são informações importantes. Se as concentrações elementares devem ser calculadas com base em peso em gramas, os dados percentuais precisam ser normalizados. Para fins estatísticos, identifique e acompanhe quaisquer blocos marrom-escuros, que são claramente encharcados de água.

Por fim, destrua as culturas em sacos autoclaváveis, guardando a malha de plástico de suporte e quaisquer outros componentes que possam ser reciclados para uso em experimentos futuros. Usando a montagem do microcosmo com blocos agrícolas, blocos de madeira de pinheiro repousam sobre uma malha de plástico para elevar os blocos acima do contato com o substrato agrícola. Os Crains circulares cresceram em contato direto com as superfícies de gesso e penetraram nos blocos de madeira.

Esse micélio representa uma conexão importante entre a madeira e as fontes exógenas de elementos nutricionais. O controle dessas fontes de materiais exógenos no ágar ou em materiais sólidos é uma vantagem fundamental do design de bloco agrícola em comparação com o design de bloco de solo, com a perda média percentual de peso como medida do grau de apodrecimento da madeira por Ser crain's após cinco e 15 semanas. A incubação com pinheiro em microssistemas de bloco agro é mostrada aqui.

Os tratamentos foram ausentes. Cloreto de cálcio a 5 milimolar foi adicionado ao ágar com mais de 99% de gipsita pura ou gipsita suplementada com 1% de ferro para cada colheita; as barras sob a mesma letra não diferem significativamente. Com as barras de erro representando o desvio padrão, observou-se perda de peso superior a 60% nos blocos de pinheiro marrom apodrecido do controle, o que atende ao objetivo padrão da Sociedade Americana de Testes e Materiais de mais de 50% de deterioração.

O coeficiente médio de variação na deterioração foi de 0,055 na semana 16. Além da baixa variabilidade, observou-se um efeito do tratamento. A deterioração fúngica foi inibida com adições de cálcio, seja ao ágar como cloreto de cálcio ou como gesso puro.

Curiosamente, as taxas de decomposição recuperam com a adição de ferro ao gesso. Isso sugere que o ferro, e não o cálcio, é essencial para observar as cinco réplicas na semana 15 da decomposição. Pelo mesmo fungo de podridão marrom, laminas circulares, a cor dos micélios revela mein.

Diferenças nas hifas externas entre os tratamentos; os blocos foram removidos, levantados e secos. Revelando a ausência de mein no tratamento sem cálcio. O amarelecimento nos tratamentos com cálcio puro e a aparência de ferrugem no tratamento com adição de ferro.

O controle representa blocos não inoculados para comparação. Curiosamente, os principais efeitos são perdidos ao se usar um meio com alto teor de ferro. Em conjunto, isso sugere que este fungo utiliza ferro, e não cálcio.

Nesses materiais, mostramos como usar uma montagem com bloco de auger para testar com sucesso a biodegradação de tecidos vegetais por fungos filamentosos aeróbicos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de evitar o contato entre os substratos, especialmente entre o tecido vegetal e o auger, minimizar o teor de umidade do auger e das plaquetas e verificar cuidadosamente se o conteúdo de cada placa não se deslocou antes da incubação. Mantendo essas variáveis em mente, é possível controlar o ambiente de decomposição muito melhor do que quando se utiliza uma montagem com bloco de solo.

Você pode gerar dados com um poder estatístico necessário para responder às suas perguntas de pesquisa. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.