Cristalização de proteínas para cristalografia de raios X
16 de janeiro de 2011
A estrutura 3-D de uma molécula fornece um entendimento único de como as funções molécula. O principal método para determinação da estrutura de quase-atômica resolução é cristalografia de raios X. Aqui, demonstramos os métodos atuais de obtenção de cristais tridimensionais de qualquer macromolécula, uma vez que são adequados para determinação de estrutura por cristalografia de raios X.
O objetivo geral deste procedimento é produzir cristais proteicos para experimentos de difração de raios X aqui. São demonstradas três técnicas diferentes para triagem de cristais: métodos de cristalização por difusão de vapor, incluindo gota suspensa e gota apoiada, bem como métodos de cristalização em microbalanço. Os poços são preenchidos com o precipitante.
Em seguida, uma alta concentração da amostra de proteína purificada é misturada ao agente precipitante. A gota mista é então selada em um poço contendo a solução precipitante. A cristalização em microbatelada começa com o preenchimento do poço com óleo de parafina.
A proteína é então carregada nos poços, seguida pela solução precipitante. O passo final de todos os métodos é deixar o sistema atingir o equilíbrio e acompanhar o aparecimento e o crescimento dos cristais dentro das gotas. Em última instância, cristais podem ser obtidos por meio desta técnica e o padrão de difração da proteína pode ser determinado utilizando uma fonte de raios X com um detector apropriado.
Olá, sou Sal do laboratório da Professora Yoga Motis do Departamento de Biofísica Molecular e Bioquímica da Universidade de Yale. Hoje vamos mostrar um procedimento para a cristalização de uma proteína purificada. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a base estrutural da infecção viral.
Então vamos começar e cultivar alguns cristais. Para identificar um método de cristalização para uma macromolécula de escolha, telas iniciais podem ser realizadas usando soluções de cristalização comercialmente disponíveis, escolhidas para explorar o método da matriz esparsa fatorial incompleto de condições experimentais. Essas condições são selecionadas com base em condições de cristalização conhecidas e comumente bem-sucedidas para macromoléculas.
Uma vez conhecida a condição de cristalização, pode-se montar uma triagem estreita variando a concentração do agente precipitante em diferentes valores de pH ao redor do resultado inicial. Geralmente, as condições de cristalização utilizadas nestas triagens consistem em um agente precipitante e um tampão para ajuste do pH; todas as soluções estoque devem ser filtradas através de um filtro de 0,22 mícron para esta demonstração. Utilizam-se as condições de cristalização previamente identificadas para a lisozima de galinha, com cloreto de sódio como agente precipitante; inicie o procedimento preparando soluções de um mililitro com várias concentrações de cloreto de sódio em acetato de sódio 0,1 molar e diferentes valores de pH.
A seguir, descongele a amostra proteica armazenada a menos 80 graus Celsius e mantenha-a em gelo. Concentrações típicas de proteína estão na faixa de cinco a 50 miligramas por mililitro, sendo que concentrações mais altas geralmente proporcionam melhores resultados. Aqui, utiliza-se uma solução de 50 miligramas por mililitro de lisozima de ovo de galinha em acetato de sódio 0,02 molar, pH 4,9.
Centrifugue a amostra por 15 minutos a 18.000 G e quatro graus Celsius para remover quaisquer proteínas parcialmente agregadas ou precipitado proveniente da etapa de descongelamento. Esses agregados podem interferir no crescimento dos cristais e promover agregação adicional. Após a centrifugação.
Determine a concentração da proteína a partir de sua absorbância em 280 nanômetros utilizando um espectrofotômetro UV. A concentração da proteína pode ser calculada a partir da leitura de absorbância e do coeficiente de extinção da proteína. Uma vez que a amostra de proteína esteja pronta, preencha uma placa de cristalização em poços suspensos de 24 poços com 500 microlitros de solução precipitante de acordo com o mapa da placa.
Crie um anel de graxa de silicone ao redor da borda de cada poço sem fechar perfeitamente o anel, para que o ar possa escapar durante o fechamento do poço. Limpe a lamínula com spray de ar comprimido ou com um lenço profissional para evitar poeira, o que facilitará a interpretação das gotas de cristalização e eliminará contaminações. O próximo passo é pipetar volumes iguais da amostra proteica e da solução do reservatório sobre a lamínula.
No entanto, diferentes volumes de proteína e precipitante podem ser testados como parte do processo de otimização; o uso de mais proteína do que precipitante resulta em uma concentração líquida da proteína na gota em equilíbrio, o que pode ser desejável para amostras de proteína diluídas ou para retardar a nucleação ou o crescimento de cristais. Para esta demonstração, dois microlitros de lisozima a 50 miligramas por mililitro em acetato de sódio 0,02 molar, pH 4, são colocados no centro da lamínula, seguidos por dois microlitros da solução de cristalização.
Ao pipetar a solução proteica e a solução reservatório sobre a lamínula, tenha extremo cuidado para evitar a formação de bolhas, o que frequentemente ocorre quando o ar é expulso da pipeta. Misture suavemente a gota para ajudar a prevenir a precipitação prematura da proteína devido a concentrações localmente elevadas de agente precipitante; a mistura é particularmente importante para agentes precipitantes viscosos, como polietilenoglicol, utilizando pinças. Vire suavemente a lamínula e coloque-a sobre o anel de graxa na parte superior do poço, realizando esse procedimento de maneira direcional para que o ar possa escapar do poço.
Caso contrário, o ar pode levantar a lamínula, comprometendo o selamento do poço. Prossiga para o próximo poço até que a placa esteja completa. Após a montagem da placa, inspecione-a visualmente, eliminando partículas de poeira e outras contaminações que podem aumentar a identificação falsa de cristais de proteína.
Utilize uma ficha de pontuação para documentar o experimento. Em seguida, coloque a bandeja na temperatura desejada de incubação, geralmente entre quatro graus Celsius e a temperatura ambiente. A temperatura mais eficaz é 20 graus Celsius.
Manuseie a bandeja com cuidado e evite qualquer vibração ou mudança de temperatura durante a transferência ou incubação, pois isso pode impedir o crescimento de cristais ou afetar negativamente a qualidade dos cristais. Verifique a bandeja quanto à presença de cristais no dia seguinte e depois a cada poucos dias, manuseando sempre as bandejas com cuidado. Documente todas as observações e as morfologias das gotas em uma ficha de pontuação específica para a bandeja.
Os cristais geralmente levam de dois a cinco dias para aparecer, embora às vezes possam surgir quase imediatamente ou até vários meses depois. Uma vez identificadas as condições de cristalização e conhecida a taxa de crescimento dos cristais, é melhor deixar as placas sem perturbação até que os cristais tenham aparecido e atingido pelo menos metade do seu tamanho final. Manter as placas sem perturbação pode reduzir o número de eventos de nucleação cristalina, resultando, assim, em um número menor de cristais maiores. Para a cristalização em gota apoiada, siga o mesmo procedimento utilizado para a gota suspensa, exceto pelo fato de usarmos uma placa de 24 poços para gota apoiada, na qual lâminas de cobertura não são necessárias.
Em vez disso, o poço contém uma plataforma na qual a proteína e o precipitante são misturados por pipetagem: dois microlitros de uma solução de lisozima a 50 miligramas por mililitro no centro da plataforma, evitando a formação de bolhas de ar. Em seguida, adicione dois microlitros da solução de precipitante à amostra após a montagem da bandeja. Sobre os poços, coloque fita óptica com gota sentada.
Não são necessárias lamínulas de cobertura. Continue a incubação e a avaliação dos cristais conforme descrito para a técnica de gota suspensa. Para realizar um procedimento de microbatelada.
Prepare a solução de cristalização e a proteína conforme descrito para o procedimento de gota suspensa. Obtenha uma nova bandeja de micro-lote e utilize um spray de ar para evitar poeira e outras partículas grandes na bandeja de micro-lote. Adicione óleo de parafina a cada poço até uma profundidade de três milímetros.
Em seguida, remova o excesso de óleo. Depois, carregue um microlitro da solução proteica no poço pré-preenchido, certificando-se de que a gota afunde até o fundo do poço. Em seguida, adicione um microlitro da solução precipitante no poço.
Certifique-se de que a gota afunde até o fundo do poço e se funda com a gota de proteína. Prossiga para o próximo poço até que a placa esteja completa e continue com a incubação e análise de cristais conforme descrito aqui. Resultados típicos da cristalização de proteínas.
Experimentos são mostrados. A precipitação amorfa ocorre quando a proteína e/ou o precipitante estão em alta concentração. Por outro lado, gotas que são insaturadas geralmente permanecem claras.
A separação de fases pode ocorrer quando a proteína ou o detergente se separam para uma fase distinta ao serem misturados com certos precipitantes em alta concentração. Em condições ideais, os cristais de proteína devem formar-se em Arabidopsis csn. Sete cristais de proteína obtidos em polietilenoglicol 8.000 e acetato de magnésio apresentam-se com formato de bastão.
Os cristais mostrados também são cristais de proteína lisossômica obtidos em uma molar, cloreto de sódio e acetato de sódio. pH 4,9. Este filme com lapso de tempo demonstra que os cristais lisossômicos crescem formando grandes prismas em poucas horas após a montagem, ao utilizar o método da gota suspensa.
Acabamos de mostrar como montar um experimento com proteínas ao realizar este procedimento. É importante trabalhar em um ambiente com controle estável de temperatura e umidade, pois a alta umidade ajuda a minimizar a evaporação da gota; procure adotar uma técnica que minimize a exposição da gota ao ar livre. Por essa razão, é essencial operar em um ambiente de trabalho bem organizado.
Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo demonstra métodos para produzir cristais de proteínas adequados para experimentos de difração de raios X. Destaca técnicas como cristalização por difusão de vapor e cristalização em microleitos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Estrutural
- Cristalografia
- Ciência Macromolecular
Antecedentes
- A estrutura tridimensional das moléculas é fundamental para compreender suas funções.
- A cristalografia de raios X é um método principal para determinação de estruturas.
- Obter cristais adequados é essencial para uma análise precisa.
- Existem várias técnicas de cristalização para facilitar esse processo.
Objetivo do Estudo
- Produzir cristais de proteínas de alta qualidade para difração de raios X.
- Demonstrar técnicas eficazes de cristalização.
- Aprimorar a compreensão das estruturas macromoleculares.
Métodos Utilizados
- Métodos de cristalização por difusão de vapor (gota pendente e gota apoiada).
- Técnicas de cristalização em microlote.
- Uso de agentes precipitantes para promover o crescimento de cristais.
- Hermetização de gotas mistas em poços contendo soluções precipitantes.
Resultados Principais
- Demonstração bem-sucedida de diversas técnicas de cristalização.
- Ilustração do processo para preparar amostras de proteínas.
- Compreensão das condições necessárias para a formação de cristais.
- Potencial para melhoria na determinação de estruturas por meio desses métodos.
Conclusões
- A cristalização eficaz é fundamental para estudos de difração de raios X.
- Diferentes técnicas podem ser empregadas com base em necessidades específicas.
- Compreender esses métodos aprimora a pesquisa em biologia estrutural.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A cristalização de proteínas é um gargalo crítico na biologia estrutural, impactando diretamente a capacidade de determinar estruturas de alta resolução para validação de alvos e redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos. Métodos confiáveis de cristalização permitem confiança preditiva em ensaios estruturais, apoiando a identificação de compostos líderes e o desenvolvimento de modelos pré-clínicos ao fornecer informações em nível atômico sobre a função proteica e interações com ligantes. Essa capacidade é essencial para reduzir riscos associados aos alvos no início do processo de descoberta e orientar decisões sobre portfólios com base em evidências estruturais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio de estruturas em resolução atômica que esclarecem a função proteica e os sítios de ligação.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos ao fornecer evidências estruturais de interação com o alvo e mecanismo de ação.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança na seleção de alvos ao revelar vulnerabilidades estruturais e potencial farmacológico.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Produz sistemas biológicos validados (cristais de proteínas) adequados para triagem estrutural subsequente e descoberta de fragmentos líderes.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação de amostras por meio de montagens reprodutíveis de cristalização (gota suspensa, gota apoiada, microbatelada) que reduzem a variabilidade em ensaios estruturais.
- Prontidão do Ensaio: Permite avaliação confiável de compostos ao gerar cristais de qualidade para difração, que servem como insumos para triagem de fragmentos por raios X e estudos de SAR.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas estruturais da fase inicial à validação pré-clínica, permitindo a otimização orientada por estrutura de compostos líderes.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece as relações entre estrutura e função que orientam o perfil de segurança e a avaliação de riscos de alvos secundários.
- Confiabilidade Preditiva: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao vincular dados estruturais a desfechos funcionais em sistemas relevantes para a doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e o desenvolvimento pré-clínico, onde dados estruturais orientam ciclos iterativos de design.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao fornecer estruturas tridimensionais que revelam domínios funcionais e interfaces de interação.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio da produção reprodutível de cristais, facilitando a triagem estrutural em alto rendimento de bibliotecas de compostos.
- Análises: Gera saídas estruturais quantitativas (mapas de densidade eletrônica, fatores B) que permitem às equipes comparar estados ligados a ligantes e estados apó para o planejamento baseado em estrutura.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao permitir a otimização orientada por estrutura de compostos líderes e a validação de alvos alinhada a biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade reutilizável de biologia estrutural que apoia múltiplos projetos em diferentes áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da validação de alvos, redução da ambiguidade mecanicista e compreensão estrutural da função proteica.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade da produção de cristais em formatos de difusão de vapor e em lote.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre continuidade ou interrupção de projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados por meio da desconsideração precoce de riscos estruturais.
- Impacto na Carteira: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base em evidências estruturais da druggabilidade do alvo e acessibilidade do sítio de ligação.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em purificação de proteínas, biofísica e triagem de cristalização para alcançar homogeneidade e evitar agregação.
- Depende do acesso a robôs de cristalização, sistemas de imagem e equipamentos de difração de raios X para monitoramento de cristais e coleta de dados.
- Necessita padronização entre equipes envolvendo produção de proteínas, biologia estrutural e química medicinal para uma transferência eficaz dos dados.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes propriedades das proteínas (tamanho, solubilidade, estabilidade) e condições de tampão entre classes de alvos.
- Limitado pela variabilidade inerente aos resultados de cristalização, o que pode exigir triagem extensiva de condições mesmo com protocolos otimizados.
