Criopreservação de tecido cortical Blocos de Geração de culturas altamente enriquecido Neuronal
11 de novembro de 2010
Aqui, nós descrevemos um método eficiente para criopreservação e descongelamento de blocos de tecido cortical do cérebro para gerar altamente enriquecido culturas neuronal. Este protocolo simples, fornece flexibilidade para a geração posterior de culturas de células neuronais, astrócitos, e neuronal precursor.
Olá, meu nome é Alan e sou do laboratório da Dra. Horney Lu, da Universidade da Califórnia em Irvine, no Departamento de Neurobiologia e Comportamento. E eu sou Bob. Hoje, a Dra. Haro mostrará a vocês um protocolo rápido, eficiente e confiável para a criopreservação rotineira de blocos de tecido cortical, visando o subsequente estabelecimento de culturas primárias neuronais de alta qualidade.
Então vamos começar. O tecido limpo e picado é colocado em frascos criogênicos contendo meio de congelamento com 10% de DMSO.
Os tubos criogênicos são colocados em um recipiente de congelamento e armazenados a menos 80 graus Celsius por pelo menos quatro horas. Os tubos criogênicos congelados são então transferidos para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Para o cultivo, o tubo criogênico é descongelado em banho-maria aquecido e lavado com HBSS morno para remover o DMSO remanescente.
HBSS fresco é adicionado juntamente com tripsina para dissociação, após o qual DMM com 10% EBS é adicionado. Para interromper a atividade enzimática dissociativa, as células são centrifugadas e o pellet é ressuspenso em DMM fresco mais 10% EBS e plaqueado em placas pré-revestidas com polilisina. Após 24 horas, o DMM é substituído por um meio neurobasal suplementado e cultivado por 10 dias.
Este protocolo utiliza uma lâmina de aço para cortar o tecido cortical antes do uso. A lâmina deve ser esterilizada em etanol 70% por pelo menos duas horas. Uma vez a solução salina tamponada com Hank (HBSS) é preparada pela diluição de uma solução estoque 10 vezes em água esterilizada; a solução uma vez HBSS é então mantida em gelo ou a quatro graus Celsius até o processamento do tecido.
O óxido sulfídrico dimetílico ou DMSO é utilizado como crioprotetor no meio de congelamento. Este protocolo utiliza uma diluição de 10% em volume de DMSO em um X-H-B-S-S-D-M-S-O que deve ser completamente misturado antes do armazenamento a quatro graus Celsius. Um recipiente de congelamento Nalgene é utilizado para controlar a taxa de congelamento das amostras.
O recipiente de congelação é carregado com criotubos de 2,5 mililitros que foram previamente rotulados. Também é recomendável rotular os próprios recipientes de congelação, caso você tenha mais de um, e anotar o recipiente correspondente na amostra de bile. A solução crioprotetora com DMSO 10% previamente resfriada, assim como o recipiente de congelação, são levados para dentro de uma cabine de segurança biológica estéril.
Aqui, um mililitro de meio de congelamento é lentamente adicionado a cada um dos frascos criogênicos. Após verificar que as tampas estão bem fechadas, coloque o recipiente de congelamento com os frascos a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas, logo antes do processamento do tecido. A lâmina de barbear previamente esterilizada precisa ser bem enxaguada. Três lavagens de três minutos.
O uso de água esterilizada deve ser suficiente para remover qualquer etanol remanescente. Este procedimento de lavagem deve ser rápido, pois a lâmina é propensa à oxidação por imersão prolongada em água estéril. Antes da limpeza, o tecido deve ser colocado sobre uma bolsa de gelo.
Lave levemente com uma X-H-B-S-S fria para remover qualquer detrito solto. Agulhas esterilizadas são usadas para limpar os fragmentos de tecido de quaisquer membranas e vasos sanguíneos remanescentes. É necessário ter cuidado para preservar a integridade estrutural do tecido durante a limpeza.
À medida que isso aumentar, a eficiência do picotamento do tecido limpo será visivelmente diferente da do tecido bruto e deverá ter a maioria das membranas ou vasos sanguíneos removidos. Uma vez que o tecido tenha sido limpo e enxaguado, o picotamento pode ser iniciado. É importante fazer cortes precisos no tecido, criando blocos com aproximadamente um milímetro cúbico de tamanho.
Blocos que são muito grandes resultam em um rendimento celular menor após o descongelamento. Os blocos menores, no entanto, devem evitar o processamento excessivo. O tecido picado pode ser coletado usando uma pipeta automática e um pouco de H-B-S-S X frio.
Certifique-se de lavar a placa com HBSS para recuperar todo o tecido coletado. O tecido é então adicionado a um grande volume de HBSS 1X e deixado decantar até o fundo, formando um pellet frouxamente compactado. Isso remove qualquer detrito remanescente que possa estar presente enquanto o tecido se sedimenta no HBSS. Recupere o recipiente de congelamento previamente resfriado e os criotubos antes de distribuir o tecido.
Certifique-se de destampar todos os frascos para acelerar o processo de preenchimento do tecido. A exposição ao DMSO em temperatura ambiente deve ser limitada a não mais de 10 minutos. É recomendável trabalhar com um recipiente de congelamento por vez até que todo o tecido seja utilizado.
Comece a aspirar o sobrenatante de um tecido solto, posicionando o pipetador o mais próximo possível do pellet sem perturbá-lo. Em seguida, acople uma ponteira de orifício largo de 200 microlitros a uma pipeta. Não utilize um orifício de ponteira menor, pois isso comprometerá a estrutura dos blocos que vão para o fundo do pellet do bloco de tecido.
Colete 200 microlitros de tecido lentamente. Adicione este tecido a um tubo criogênico e prossiga para o próximo até que todos os tubos estejam cheios. Pode ser necessário seguir uma regra de 10 minutos.
Coloque rapidamente o recipiente de congelamento em tubos criogênicos no congelador a menos 80 graus Celsius por pelo menos quatro horas ou durante a noite, caso o tempo seja limitado. Após tempo suficiente, retire o recipiente de congelamento do congelador e distribua os tubos criogênicos em uma caixa criogênica o mais rapidamente possível. Coloque a caixa criogênica em uma grade de caixa de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.
Retire um criotubo do nitrogênio líquido o mais rapidamente possível, limitando a exposição das caixas de congelação à temperatura ambiente, mergulhando-o rapidamente em banho de água a 37 graus Celsius. Mantenha sempre a tampa acima da água. Verifique com frequência e continue o descongelamento até que um pequeno cristal de gelo seja observado.
Antes de levar ao gabinete de segurança, esterilize o tubo de criopreservação com etanol 70%. Prossiga adicionando o tecido descongelado a um grande volume de HBSS aquecido a uma vez, caso o tecido permaneça nas paredes do tubo de criopreservação. Colete suavemente com HBSS.
Após coletar todo o tecido, inverta o tubo de três a quatro vezes e deixe o tecido sedimentar no fundo. Este passo garante uma diluição suficiente de DMSO.
Uma vez que o tecido esteja assentado, aspire o máximo possível do sobrenadante. Em seguida, adicione 10 mililitros de H-B-S-S fresco e aquecido a 1 X. Adicione 300 microlitros de tripsina a 0,25% e 50 microlitros de DNAse.
Prossiga com a dissociação do tecido com agitação suave, criando uma suspensão celular turva após a dissociação do tecido. Interrompa a atividade enzimática adicionando DMEM aquecido mais soro bovino enriquecido a 10% e centrifugue as suspensões celulares a 1200 ×g por cinco minutos. Re-suspenda o pellet celular em DMEM fresco mais 10% de SBE e plaque em placas revestidas com polilisina.
Deixe as células aderirem às placas por 30 minutos. Em seguida, substitua o meio por DM fresco mais 10% de EBS. Após 24 horas, substitua o meio contendo DM por meio neurobasal suplementado com N dois e B 27 e cultive por 10 dias.
Acabamos de detalhar um protocolo amplo, eficiente e confiável com preservação criogênica rotineira de blocos de tecido cortical. Boa sorte.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para a criopreservação e descongelação eficientes de blocos de tecido cerebral cortical, facilitando a geração de culturas neuronais enriquecidas. O protocolo permite o subsequente cultivo de culturas de neurônios, astrócitos e células precursoras neuronais.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Preservação de Tecidos
Contexto
- A criopreservação é essencial para manter a viabilidade do tecido cerebral.
- Técnicas eficientes de descongelamento são cruciais para um cultivo celular de alta qualidade.
- Os cultivos neuronais são fundamentais para diversos estudos neurobiológicos.
- Os protocolos devem garantir danos mínimos à integridade do tecido durante o processamento.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável de criopreservação para tecido cortical.
- Ampliar o rendimento de culturas neuronais primárias.
- Fornecer um protocolo flexível para gerar diversos tipos celulares a partir de tecido preservado.
Métodos Utilizados
- Preparação de blocos de tecido cortical utilizando uma lâmina de barbear esterilizada.
- Uso de DMSO a 10% no meio de congelamento para criopreservação.
- Descongelamento do tecido em banho-maria aquecido para minimizar a formação de cristais de gelo.
- Dissociação do tecido descongelado utilizando tripsina e DNase para cultivo celular.
Resultados Principais
- O protocolo preservou com sucesso a viabilidade do tecido cortical.
- Foram obtidas culturas neuronais de alta qualidade após o descongelamento.
- Foi demonstrada flexibilidade na geração de diferentes tipos celulares.
- Foram estabelecidos métodos eficientes para o processamento de tecidos.
Conclusões
- O método de criopreservação descrito é eficaz para tecido cerebral cortical.
- Este protocolo pode ser adaptado para diversas aplicações de cultivo neuronal.
- Estudos futuros podem se basear neste método para pesquisas neurobiológicas avançadas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A criopreservação padronizada de blocos de tecido cortical permite a geração confiável de culturas neuronais altamente enriquecidas, apoiando descobertas iniciais consistentes e o desenvolvimento de ensaios em pesquisas e desenvolvimento com foco em neurobiologia. Este protocolo aumenta a flexibilidade operacional e a eficiência de recursos ao desacoplar a coleta de tecido do início da cultura subsequente, reduzindo a variabilidade biológica e apoiando fluxos de trabalho escaláveis e reprodutíveis. A abordagem é diretamente relevante para equipes de biofármacos que buscam fontes robustas e armazenáveis de células neuronais e gliais primárias para validação de alvos e triagem.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite acesso consistente a culturas neuronais e de astrócitos de alta qualidade para estudos mecanicistas.
- Apoia a validação funcional de alvos ao fornecer sistemas celulares primários reprodutíveis.
- Facilita a redução de riscos biológicos por meio do processamento e armazenamento padronizados de tecidos.
- Aprimora a confiança preditiva na pesquisa neurobiológica em estágios iniciais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece fontes celulares validadas e reprodutíveis para padronização e otimização de ensaios.
- Permite o preparo escalonável de culturas neuronais para fluxos de trabalho de triagem de compostos.
- Oferece suporte a leituras quantitativas e reprodutibilidade entre lotes experimentais.
- Reduz a variabilidade entre lotes ao permitir o início sincronizado das culturas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Facilita a geração de culturas de células precursoras neurais para modelagem relevante à doença.
- Permite continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, possibilitando um tempo flexível para a geração da cultura.
- Alinha-se a estudos translacionais de biomarcadores que exigem fontes consistentes de células primárias.
- Reduz o risco de deriva biológica em programas de pesquisa de longo prazo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de criopreservação posiciona o banco de tecidos como uma capacidade fundamental desde as fases iniciais de descoberta até a pesquisa pré-clínica, permitindo a geração sob demanda de culturas neuronais e gliais para diversas necessidades de P&D.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses e análise de vias com culturas primárias padronizadas.
- Triagem: Fornece células prontas para ensaios para avaliação reprodutível de compostos e análise quantitativa.
- Análises: Permite medições consistentes do crescimento neurítico e da expansão da rede entre experimentos.
- Pesquisa Translacional: Facilita a integração com modelos de doenças e estudos de biomarcadores utilizando culturas derivadas de precursores neurais.
- Reutilização Corporativa: Estabelece um recurso tecidual reutilizável para múltiplos projetos e equipes multifuncionais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em ensaios neuronais.
- Valor Operacional: Padroniza o processamento de tecidos, melhora a reprodutibilidade e sustenta fluxos de trabalho escaláveis.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de avanço ou interrupção e a eficiência do capital ao reduzir riscos biológicos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de programas de neurobiologia.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em manipulação estéril de tecidos e técnicas de cultivo celular primário.
- Requer acesso a equipamentos de congelação com taxa controlada e armazenamento em nitrogênio líquido.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de processamento e rotulagem de tecidos.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes regiões cerebrais ou espécies.
- O rendimento celular e a viabilidade dependem do dimensionamento preciso e da manipulação dos blocos conforme descrito.
