Dispositivo microfluídicos para Recriando um microambiente do tumor

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a fabricação e o funcionamento de um dispositivo microfluídico que recria microambientes tumorais in vitro e pode ser utilizado para testar medicamentos quimioterápicos. Este é o dispositivo microfluídico. Esse dispositivo pode ser útil nas seguintes áreas: testes simples de medicamentos quimioterápicos in vitro.

Ele fornece resultados consistentes e precisos para testar tecido tumoral tridimensional, e este dispositivo oferece uma representação muito precisa de tumor in vivo. Microambientes tumorais existem em microambientes 3D e a capacidade de testar em um deles é significativa. O primeiro passo do procedimento é montar o dispositivo, o que envolve a fabricação de um chip microfluídico utilizando litografia macia, perfuração de orifícios nas entradas e saídas, ligação a uma lâmina de vidro e conexão de tubos para entrada e saída de fluxo.

Em seguida, os esferoides tumorais multicelulares uniformes são gerados para uso no dispositivo utilizando o método da gota suspensa. Os esferoides são então introduzidos no dispositivo, seguidos por agentes de detecção de apoptose e fármacos quimioterápicos. Por fim, é realizada microscopia de tempo-lapso, seguida pela estimativa matemática dos coeficientes de difusividade dos fármacos, para quantificar a capacidade de penetração do agente quimioterápico.

No fim, podem ser obtidos resultados que mostram o crescimento tecidual na formação de microambientes heterogêneos dentro do tecido e a difusão de fármacos no tecido por meio da microscopia de fluorescência com lapso de tempo. A penetração limitada de fármacos anticancerígenos em tumores sólidos é uma causa importante de seu fracasso. A maioria dos modelos atuais de teste de fármacos anticancerígenos não imita a natureza tridimensional dos tumores sólidos.

Desenvolvemos um dispositivo microfluídico composto por tecidos tumorais tridimensionais perfundidos continuamente. Este modelo representa com maior precisão a entrega de fármacos a tumores sólidos e sua eliminação sistêmica. Os esteroides tumorais multicelulares são um modelo bem estabelecido de tecidos tumorais tridimensionais.

Neste procedimento, o método da gota suspensa é utilizado para criar esferoides para uso no dispositivo microfluídico. Este método permite a formação de esferoides consistentes em um curto período de tempo. O teste de fármacos quimioterápicos in vitro em tecidos tridimensionais pode ajudar na triagem de fármacos de maneira mais eficiente em comparação com monocamadas de células.

Misture a PDMS e o agente de cura do elastômero de silicone em uma proporção de nove para um em peso. Em seguida, despeje essa mistura sobre o molde para formar uma camada de quatro milímetros de espessura. Para remover bolhas de ar, cure a 60 graus Celsius por cinco horas.

Descasque o PDMS curado do molde para obter um carimbo com as características de fluxo no elastômero. Em seguida, utilizando uma perfuradora de biópsia de um milímetro e meio acoplada a uma broca, faça orifícios para as entradas e saídas. Remova todos os detritos.

Submeta o lado com o padrão do carimbo e uma lâmina de vidro limpa ao plasma de oxigênio por oito minutos. Em um atacador a plasma de oxigênio, coloque imediatamente as superfícies tratadas em contato para formar uma ligação entre elas. Mantenha o conjunto a 60 graus Celsius em um aquecedor de lâminas por pelo menos cinco horas.

Para reforçar a ligação, conecte tubos de PTFE com diâmetro interno de 0,032 polegadas às entradas e saídas do dispositivo microfluídico. Utilizando uma interface de conectores machos com trava rosqueável acoplados a conectores fêmeas com encaixe por barbatanas, esses conectores específicos são usados para permitir a passagem fácil sem rompimento. Por fim, monte a montagem de fluxo utilizando válvulas de fechamento e um conector em Y, fixando o dispositivo no microscópio. Após a fixação do dispositivo, conecte os tubos às entradas e saídas apropriadas para completar a configuração de fluxo.

Como mostrado nesta figura, essa configuração permite a facilidade e versatilidade de acomodar um esferoide no dispositivo ou criar um fluxo de meio através do dispositivo para acomodação. Abra a válvula de entrada de acomodação VPN e a válvula de saída de acomodação VP para fora do tumor. O OID pode então passar pela entrada e fluir para a câmara de cultura, onde o pino nesta câmara manterá o tumor no lugar para permitir a passagem do meio.

Feche as válvulas de empacotamento e abra a válvula de entrada de fluxo VF in e a válvula de saída de fluxo VF out para iniciar a formação de PHE uniforme. Usando o método da gota suspensa, trypsinice as células sob uma capela de cultura. Retire as células de tripsina resultantes do centrífugo.

Dilua a solução estoque até a concentração desejada consultando a tabela um. Em seguida, remova a tampa de uma placa de 48 poços e coloque-a de cabeça para baixo. Em uma cabine esterilizada, preencha cada poço da placa com um mililitro de água esterilizada.

Para manter a umidade, coloque uma gota de 20 microlitros de solução diluída de células em cada região circular da lamínula. Usando uma micropipeta, inverta cuidadosamente a lamínula e coloque-a sobre a placa, garantindo que as gotas não toquem nas bordas dos poços. Incube a placa a 37 graus Celsius.

Consulte a tabela um para a duração da incubação com base no tipo específico de célula utilizado; um esteroide se formará em cada gota suspensa. Comece esterilizando o dispositivo lavando-o com etanol 70% através da entrada de fluxo. Em seguida, faça uma lavagem com PBS e, depois, com meio de cultura celular tamponado com H-E-P-E-S.

Deixe a seringa média e conecte-a ao tubo. Em seguida, aspire dois a três esteroides na torneira da seringa. Para remover bolhas de ar, conecte a seringa à entrada de embalagem do dispositivo.

Abra a válvula de entrada VPN e feche VFN, abra a válvula de saída VP out e feche VF out. Mantenha a seringa de embalagem na posição vertical com a agulha apontando para baixo. Observe enquanto o esteroide se deposita no fundo da seringa, no conector com trava do tipo lure lock da agulha.

Pressione o êmbolo da seringa de empacotamento e observe o PHE entrar no tubo e fluir para o dispositivo, pois somente a válvula de saída de empacotamento está aberta. Um esteroide entrará na câmara do dispositivo e será retido pelos postes na parte traseira. Uma vez dentro da câmara, o esferoide S se adapta ao formato da câmara e assume uma geometria retangular.

Feche a válvula de entrada VPN e a válvula de saída VP, conecte a seringa de fluxo SF à bomba de seringa. Esta bomba é operada por um computador usando o programa Syringe Pump Pro; abra a válvula de entrada VFN e a válvula de saída VF. Inicie o fluxo do meio no dispositivo a três microlitros por minuto.

A incubação do esferoide por 24 horas é seguida pela introdução de agentes detectores de apoptose. Antes de introduzir agentes detectores de apoptose ou agentes terapêuticos, aguarde até 24 horas para permitir o equilíbrio do esferoide, estabelecendo gradientes de nutrientes e microambientes. Em seguida, feche a válvula VFN.

Interrompa a bomba de seringa. Remova a seringa da bomba e substitua-a pela seringa contendo meio com 0,25 microlitros por mililitro do marcador ativo de Caspase três CASP glow red. Lave o dispositivo com a solução, passando manualmente 0,7 mililitros dela através do dispositivo.

Em seguida, acople a seringa à bomba. Reinicie o fluxo e abra a válvula VFN. Ao longo de um período de cinco a oito horas, o agente ativo CPH do cask glove vermelho da fase três difundirá nos tecidos e fluorescerá mais intensamente em regiões apoptóticas. O agente detectável de apoptose nesta concentração é mantido em todas as soluções de fluxo subsequentes.

A doxorrubicina é introduzida de cinco a oito horas após a introdução dos agentes de detecção de apoptose. Este tratamento é removido do sistema por lavagem. Para adicionar agentes quimioterápicos, siga o procedimento para detecção de apoptose a fim de introduzir 10 micromolar de cloridrato de doxorrubicina.

Em seguida, substitua a seringa do tratamento pela seringa com 0,7 mililitros de meio. Continue o fluxo do agente terapêutico por um período fixo de tempo. Em seguida, feche a válvula VFN e desligue a bomba de seringa.

Remova a seringa de tratamento da bomba de seringa e substitua pela seringa contendo 0,7 mililitros de meio. Permita o fluxo de meio fresco por 24 a 36 horas, monitorando continuamente o tecido sob um microscópio. Todo o processo de aquisição para microscopia com lapso de tempo foi automatizado usando um script personalizado no IP Lab, adquirindo imagens de luz transmitida e de fluorescência do PAX Foid a 10 x de ampliação a cada 30 minutos. Para a estimativa matemática dos coeficientes de difusividade do fármaco, o primeiro passo é gerar perfis médios de intensidade linear da fluorescência de docs usando o ImageJ. Selecione uma região retangular de interesse, ou ROI, que englobe o tecido na câmara.

Utilize o comando perfil do gráfico para gerar um perfil das intensidades médias em função da distância do canal de fluxo. Repita para até três pontos de tempo diferentes. Em seguida, subtraia a intensidade média de fluorescência de fundo dos perfis de intensidade obtidos e normalize cada perfil utilizando a intensidade máxima correspondente para obter C como função de X e T. Onde C é a concentração normalizada de doxorrubicina, o valor de C varia entre zero e um.

O próximo passo é avaliar o coeficiente de difusão efetivo de docs no tecido tumoral docs. A difusão pode ser representada pela seguinte equação, em que ERFC é a função de erro complementar. X é a distância no tecido a partir do canal, e T é o tempo após a introdução da doxorrubicina.

Utilize o seguinte esquema iterativo em cada ponto temporal considerado. Estime um valor para D. Calcule o lado direito da equação em cada localização. X. Calcule a soma dos erros quadráticos entre os dois lados e modifique D para minimizar a média dos resíduos.

Os valores ótimos de D obtidos em cada ponto temporal para estimar o coeficiente médio efetivo de difusão da doxorrubicina no tecido. Os dispositivos microfluídicos forneceram câmaras de cultura opticamente acessíveis de um milímetro por 0,3 milímetro por 0,15 milímetro para o crescimento de tecido tumoral tridimensional. O método da gota suspensa permitiu a rápida formação de PEH tumorais de tamanho e forma consistentes a partir de várias linhagens celulares.

PHE foram cultivadas com sucesso no dispositivo por até três dias. O crescimento nas câmaras foi associado à modificação reprodutível dos microambientes. Dentro das PHE, a apoptose ocorreu menos em células próximas ao canal de fluxo e foi maior e mais profunda no tecido.

O dispositivo foi utilizado para estimar o coeficiente de difusão da doxorubicina e do tecido tumoral. O valor obtido experimentalmente concordou com o valor relatado anteriormente em câncer de mama humano. Ao realizar este procedimento, é importante ter extrema cautela em manter a esterilidade ao fluir o PHE para dentro do dispositivo, pois esse passo deve ser realizado fora do ambiente de cultura celular.

Pulverize generosamente as seringas do capuz e as extremidades dos tubos com etanol para garantir a esterilidade. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender o papel da penetração limitada de fármacos em tumores. Demonstramos uma técnica para simular a entrega e a eliminação sistêmica de fármacos em tecidos tumorais tridimensionais e quantificar sua penetração.

Eliminar medicamentos com baixa penetração reduzirá significativamente o processo de desenvolvimento de medicamentos contra o câncer.