Quantificação de dsDNA usando a Hitachi F-7000 Espectrofotômetro de Fluorescência e PicoGreen Dye
5 de novembro de 2010
Demonstração de quantificação de dsDNA usando Molecular Probes PicoGreen corante e Hitachi Espectrofotômetro de Fluorescência F-7000 equipado com um acessório de leitor de microplacas.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a capacidade do espectrofotômetro de fluorescência F 7,000 com leitor de microplacas de realizar a quantificação de DNA de dupla fita utilizando o corante Pico green. Isso é realizado primeiramente preparando as amostras e os reagentes. O segundo passo do procedimento é configurar o instrumento.
O terceiro passo do procedimento é carregar as amostras no leitor de microplacas. O passo final do procedimento é realizar a medição dos padrões e das amostras. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram uma curva de calibração linear, a qual pode ser utilizada para a quantificação de DNA de dupla fita em amostras desconhecidas.
Ligue o Espectrofluorímetro Hitachi F 7,000 para permitir que a lâmpada de xenônio aqueça por uma hora no Excel. Crie um arquivo com os dados dos padrões e das amostras e salve-o em formato de valores separados por vírgula ou CSV. Para configurar o espectrofluorímetro primeiro, clique no botão de método que abre a janela de método de análise.
No campo de medição, selecione fotometria no menu suspenso. Agora, clique na guia de quantificação. No campo de tipo de quantificação, selecione comprimento de onda para indicar que a leitura de fluorescência será feita usando um comprimento de onda específico.
Para o tipo de calibração, selecione primeira ordem e, para o número de comprimentos de onda, selecione um. Insira nanogramas por mililitro como unidade de concentração. Certifique-se de que as opções de calibração manual e forçar a curva a passar pelo zero não estejam marcadas. Após a vírgula decimal, selecione dois, insira zero para o limite inferior de concentração e 10.000 para o campo do limite superior de concentração.
Em seguida, clique na guia do instrumento e, no campo modo de dados, selecione fluorescência. Verifique se o campo velocidade de corte está inativo, pois é utilizado apenas em medições de fosforescência. No campo modo de comprimento de onda, selecione ambos WL fixo no campo ex WL um e insira 480 nanômetros no campo EM WL um.
Digite 520 nanômetros. Mantenha todos os outros campos em EX e EM inativos. Ajuste a fenda de excitação e a fenda de emissão para 5,0 nanômetros.
Usando os menus suspensos, mantenha a caixa diante do campo de tensão do PMT de um a 1000 volts desmarcada. Para a tensão do PMT, selecione 700 volts no menu suspenso. Além disso, selecione dois para o número de cálculo automático de estatísticas, um para réplicas, 0,1 segundos para o tempo de integração e zero para o atraso.
Agora abra a guia monitor e defina o campo máximo do eixo y para 10.000 e o mínimo do eixo y para zero. Em seguida, selecione a caixa à esquerda de processar dados após a aquisição e, se necessário, a caixa à esquerda de imprimir relatório após a aquisição para gerar um relatório que será impresso automaticamente ao final das leituras. Por fim, para salvar todos os parâmetros selecionados nas diferentes guias da janela do método de análise, clique na guia geral e salve com um novo nome de arquivo em um local especificado.
Clique no botão OK para fechar esta janela. Isso conclui a configuração dos parâmetros de teste do instrumento. Para configurar o leitor de microplacas, clique no botão MPR para trazer a janela de configuração do MPR para a frente.
Primeiro, selecione os poços para os padrões. Por exemplo, clique na posição A1 e arraste o mouse até E1. Em seguida, clique no botão definir padrão.
Isso selecionará as posições a serem usadas para os padrões, destacadas na cor verde. Em seguida, selecione as posições para as amostras. De forma análoga, clique e arraste o mouse sobre as posições correspondentes na placa e, então, clique no botão do conjunto de amostras, que automaticamente destacará as posições selecionadas em amarelo.
Continue repetindo a mesma operação para as posições das medições de amostra desejadas. Para carregar as informações dos padrões e das amostras no arquivo de variáveis separadas por vírgula preparado anteriormente, clique na aba de informações dos poços da janela de configuração do MPR.
Selecione o botão de informações do poço de carga e uma janela do Windows Explorer será aberta para identificar o arquivo csv de informações dos poços. Após carregar as informações, a janela deve exibir uma tabela. Para preparar uma solução de trabalho do reagente Pico Green, adicione 50 microlitros do reagente Pico Green 200 X a 9,95 mililitros de tampão TE.
Para a curva padrão, prepare diluições seriadas de DNA duplo-filamento Lambda em tampão TE para concentrações finais variando de um a 100 nanogramas por mililitro; pipete 150 microlitros de cada padrão em poços designados de uma placa de 96 poços. Em seguida, pipete 150 microlitros de cada amostra teste nos poços correspondentes da placa. Agora, utilizando uma pipeta multicanal, adicione 150 microlitros da solução Pico Green a cada poço e misture a solução e as amostras de DNA.
Incube suavemente a placa em local escuro por dois a cinco minutos para que a reação se desenvolva. Clique no botão da tela de exibição do MPR para trazer a janela de configuração do MPR para a frente da tela e clique no botão de troca de posição. A plataforma de sustentação da microplaca mover-se-á para a frente do instrumento, abrirá a porta do leitor de microplacas e colocará a placa de 96 poços sobre a plataforma de sustentação com o poço A1 voltado para a frente, fechando em seguida a porta do leitor de microplacas.
Clique no botão de posição inicial para posicionar o ponto A em um dos poços da microplaca na posição de medição. Clique no botão de exibição do monitor para trazer a janela de medição para o topo da tela. Clique no botão de medição para iniciar a leitura dos padrões e das amostras desconhecidas.
Uma boa curva de calibração é avaliada utilizando os diferentes parâmetros fornecidos pelo software F 7,000. Por exemplo, esta curva de calibração ideal obtida para a quantificação de DNA de dupla fita utilizando o corante Pico Green apresenta um coeficiente de determinação calculado de 0,99993. O sistema de alto rendimento descrito é uma montagem em série de tecnologias que inclui o corante Pico Green, um espectrofotômetro de fluorescência Hitachi F 7,000, equipado com leitor de microplacas e um programa de software para automatizar a coleta, armazenamento, análise e apresentação de dados.
A combinação de tecnologias avançadas pode atender à crescente necessidade de analisar com precisão pequenas quantidades de DNA de dupla fita.
Visão Geral
Este artigo demonstra a quantificação de DNA de dupla fita (dsDNA) utilizando o corante PicoGreen e o Espectrofotômetro de Fluorescência Hitachi F-7000 com leitor de microplacas. O procedimento descreve o preparo das amostras, a configuração do instrumento e os processos de medição para obter uma curva de calibração linear para a quantificação de dsDNA.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Espectroscopia de fluorescência
- Quantificação de DNA
- Tecnologia de leitor de microplacas
Contexto
- O corante PicoGreen é um corante fluorescente sensível usado para quantificar DNA dupla-fita.
- O Hitachi F-7000 é um espectrofotômetro de fluorescência versátil.
- A quantificação precisa de DNA é essencial para diversos experimentos biológicos.
- Sistemas de alto rendimento facilitam a análise de múltiplas amostras simultaneamente.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a capacidade do espectrofotômetro F-7000 na quantificação de DNA dupla-fita (dsDNA).
- Estabelecer um método confiável para medir amostras desconhecidas de DNA.
- Criar uma curva de calibração linear para quantificação precisa.
Métodos Utilizados
- Preparação do reagente PicoGreen e dos padrões de DNA.
- Configuração dos parâmetros do espectrofotômetro Hitachi F-7000.
- Carregamento das amostras no leitor de microplacas.
- Medição da fluorescência para gerar uma curva de calibração.
Resultados Principais
- Uma curva de calibração linear foi estabelecida para a quantificação de DNA dupla-fita.
- O método demonstrou alta sensibilidade e precisão.
- Os resultados mostraram um coeficiente de determinação de 0,99993.
- O sistema analisou efetivamente pequenas quantidades de DNA dupla-fita.
Conclusões
- A combinação do corante PicoGreen e do espectrofotômetro F-7000 fornece um método robusto para a quantificação de DNA.
- Essa abordagem de alto rendimento atende às demandas por análises precisas em pesquisas biológicas.
- O método pode ser aplicado a diversos estudos que exigem medidas precisas de DNA.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação precisa de DNA de dupla fita é um requisito fundamental para a validação de alvos, desenvolvimento de ensaios e geração de modelos pré-clínicos em pesquisa e desenvolvimento biofarmacêutico. O espectrofotômetro de fluorescência Hitachi F-7000 com corante PicoGreen permite a medição de dsDNA com alta sensibilidade e alto rendimento, apoiando a geração confiável de curvas padrão para aplicações posteriores. Este método fornece confiança preditiva na quantificação de ácidos nucleicos, reduzindo a variabilidade em fluxos de trabalho de descoberta inicial e permitindo a geração escalonável e reprodutível de dados em estudos de triagem de compostos e biomarcadores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a medição precisa de concentrações de DNA dupla-fita para clonagem, transfeção e ensaios de validação de alvo baseados em PCR.
- Valor Operacional: Apoia a preparação e quantificação reprodutível de amostras, reduzindo a variabilidade técnica em experimentos orientados por hipóteses.
- Valor Preditivo: Gera curvas de calibração lineares com altos coeficientes de determinação (R² > 0,999), garantindo a quantificação precisa de amostras desconhecidas em estudos de engajamento de alvo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece leituras quantitativas de fluorescência compatíveis com formatos de 96 poços para padronização de ensaios e titulação de reagentes.
- Valor Operacional: Permite a medição rápida de 96 poços em menos de 60 segundos utilizando o modo de cinética, favorecendo a preparação para triagem de alto rendimento.
- Escalabilidade: O software permite salvar e recuperar configurações de microplacas, facilitando a padronização consistente dos ensaios entre equipes e projetos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Fornece quantificação confiável de DNA dupla-fita para análise de biomarcadores, validação de PCR e produção de vetores em modelos pré-clínicos.
- Mitigação de Riscos: Alta sensibilidade (50 picomoles equivalente de fluoresceína) e ampla faixa dinâmica (5 ordens de magnitude) permitem quantificação precisa em séries de diluição, reduzindo falsos negativos em alvos de baixa abundância.
- Integração ao Fluxo de Trabalho: Exporta dados para formatos Excel ou relatórios, permitindo transferência contínua para pipelines bioinformáticos e analíticos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos líderes e o desenvolvimento pré-clínico, em que a quantificação precisa de ácidos nucleicos é essencial para a reprodutibilidade experimental e a integridade dos dados.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a medição precisa de DNA dupla-fita para análise de eficiência de clonagem, expressão gênica e estudos de mutagênese.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas de fluorescência reprodutíveis que apoiam a robustez do ensaio e a normalização de bibliotecas de compostos.
- Análises: Gera curvas de calibração lineares e coeficientes de determinação (R²) que permitem comparação entre experimentos e controle de qualidade.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da quantificação confiável de DNA em formulações farmacêuticas, vetores virais e ensaios de biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Software configurável e protocolos padronizados permitem reutilização entre departamentos, reduzindo o re-desenvolvimento de métodos e aumentando a eficiência operacional.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Alta sensibilidade e especificidade para DNA de dupla fita reduzem sinais falsos e melhoram a confiabilidade dos dados em ensaios moleculares.
- Valor Operacional: Coleta, armazenamento e apresentação automatizados de dados por meio de software minimizam manipulação manual e erros de transcrição.
- Valor Estratégico: A quantificação confiável apoia decisões de avanço ou interrupção na otimização de compostos ativos, garantindo dosagem e normalização precisas em ensaios funcionais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao fornecer dados confiáveis de ácidos nucleicos para seleção de candidatos e estudos de formulação.
Considerações sobre a Implementação
- Exige familiaridade com espectroscopia de fluorescência e operação de leitor de microplacas.
- Requer acesso ao espectrofotômetro Hitachi F-7000 com acessório de leitor de microplacas e software compatível.
- Exige preparação padronizada de reagentes (diluição do PicoGreen em tampão TE) e manipulação de amostras para evitar a quenching da fluorescência.
- Envolve a otimização do tempo de incubação (2–5 minutos no escuro) e das configurações de comprimento de onda (Excitação 480 nm, Emissão 520 nm) para garantir consistência do sinal.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de incubação no escuro e possíveis interferências por contaminantes ou solventes orgânicos.
