O uso do fluxo de gotejamento e Reatores de disco rotativo para Staphylococcus aureus Análise de biofilme

O objetivo geral deste procedimento é cultivar biofilmes bacterianos sob força de cisalhamento baixa ou moderada, utilizando um reator de fluxo por gotejamento ou um reator de disco rotativo. As cunhas no reator de biofilme são primeiramente inoculadas com bactérias e incubadas a 37 graus Celsius para permitir que as células bacterianas adiram às superfícies de crescimento. Uma vez que as células tenham se fixado nas cunhas, inicia-se um fluxo de meio de crescimento, gerando uma força de cisalhamento que atua durante o desenvolvimento do biofilme.

Os biofilmes maduros podem então ser colhidos para análise e observação. Pode-se realizar microscopia eletrônica de varredura para determinar a ultraestrutura dos biofilmes produzidos. Eu sou Blaze Balls.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como células de fluxo, é que permite obter facilmente alta produção de biomassa e múltiplos biofilmes idênticos. A demonstração deste procedimento será feita por Rachel Stevenson e Kelly Schwartz, uma técnica e uma aluna de pós-graduação do meu laboratório. O reator de biofilme por fluxo gotejado consiste em quatro câmaras com portas de entrada para o meio de cultura e portas de saída para o escoamento de resíduos.

Dentro de cada câmara há um cupom removível no qual o biofilme cresce. Para montar o reator de biofilme de fluxo contínuo, coloque os cupons em cada câmara paralela e fixe as tampas das câmaras. Autoclave o reator montado, bem como os tubos de nutriente de entrada, para esterilizar o sistema antes do uso.

Também esterilize em autoclave o meio de crescimento para biofilme para inocular o reator de fluxo por gotejamento esterilizado. Coloque o equipamento sobre uma superfície plana e prenda as linhas de efluente. Em seguida, encha cada câmara com 10 mililitros de meio de crescimento estéril à base de caldo triptico de soja e adicione 100 microlitros de staphylococcus aureus.

Cultura mantida durante a noite cresceu no mesmo meio em cada câmara separadamente. Coloque o reator inoculado em uma incubadora a 37 graus Celsius por 18 horas para permitir que as células aderissem à superfície do disco. Após a incubação, prenda com grampos UNC a tubulação de efluente e coloque o reator sobre um bloco de madeira inclinado a um ângulo de 10 graus. De forma asséptica.

Conecte o tubo de nutriente fluente a um frasco contendo caldo nutritivo de fluxo contínuo. Passe a linha do tubo pela bomba e escarre o tubo operando a bomba em velocidade máxima. Uma vez que o tubo fluente esteja escarreado, pare a bomba e conecte agulhas de calibre 22 com um polegada de comprimento à extremidade de cada tubo.

Limpe o tampão da entrada da câmara com um lenço umedecido em etanol de forma asséptica. Insira as agulhas através do tampão da entrada. Ligue a bomba e permita que o meio goteje sobre os discos.

Com uma vazão de aproximadamente 125 microlitros por minuto, o meio deve fluir de cima para baixo, desde a porta da rolha de entrada até a porta de efluente. Opere o reator em fluxo contínuo por três dias. Verifique ocasionalmente o reator para garantir a drenagem adequada.

A drenagem é verificada por inspeção visual das câmaras para garantir que o meio não esteja acumulando nas câmaras. Se houver acúmulo de meio, pinçar o tubo de saída geralmente promove a drenagem adequada para colher os biofilmes, pare a bomba e remova as agulhas do reator. Em seguida, coloque o reator sobre uma superfície plana.

Após três dias de fluxo contínuo, os biofilmes de Staphylococcus aureus aparecem como biomassa amarela espalhada ao longo do comprimento dos discos inoculados. Uma micrografia eletrônica de varredura do biofilme revela Staphylococcus aureus cobrindo o disco em uma comunidade de biofilme associada à superfície. Para quantificar a biomassa obtida, utilize pinças estéreis para remover os discos de forma asséptica, colher as bactérias usando um raspador celular e, em seguida, transferi-las para um tubo cônico contendo cinco mililitros de PBS estéril.

Usando um tecido, desagregue os agregados bacterianos com um homogeneizador até obter uma suspensão uniforme. As unidades formadoras de colônia são quantificadas por meio do plaqueamento de diluições seriadas em placas de ágar triptico, incubadas por 24 horas a 37 graus Celsius, seguido de contagem de colônias. O reator de biofilme com disco rotativo é composto por um quimostato pelo qual o meio de crescimento é bombeado.

Um disco giratório com uma barra em forma de estrela e 18 corpos de prova projetados para encaixar no disco giratório. Para montar o reator, primeiro insira os corpos de prova do disco giratório nas ranhuras do disco. Em seguida, coloque o disco carregado dentro de um béquer de vidro de um litro com um orifício de transbordamento e tampe o reator com uma rolha de borracha número 15 com um orifício para fluxo de meio e outro orifício para aeração.

Autoclave o reator montado e os tubos de entrada para esterilizar o sistema. Para inocular o reator, encha o béquer com 250 mililitros de meio de cultura estéril e adicione 500 microlitros de uma cultura de 24 horas de Staphylococcus aureus cultivada em caldo tripticase de soja. Coloque o reator sobre uma placa agitadora ajustada em 250 rotações por minuto e incube durante a noite a 37 graus Celsius para permitir que as células adiram aos discos.

Após a incubação durante a noite, conecte a tubulação de entrada à porta do reservatório de meio e à bomba peristáltica. Ligue a bomba e ajuste o fluxo para 0,25 mililitros por minuto. Deixe o reator funcionar por 24 horas a 37 graus Celsius para colher os biofilmes resultantes.

Pare o reator e, de forma asséptica, remova o disco sem tocar nas amostras. Usando pinças estéreis, remova as amostras e mergulhe cuidadosamente cada uma em PBS estéril para remover as bactérias fracamente aderidas antes do teste do composto antimicrobiano.

De forma asséptica, coloque as amostras em poços individuais de uma placa de 96 poços contendo os compostos de interesse. Incube a placa por quatro horas a 37 graus Celsius. Em seguida, transfira as amostras para tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro contendo PBS 1x e disperse os biofilmes utilizando um homogeneizador.

Por fim, plaque diluições seriadas das células em meio ágar nutriente para determinar o número de unidades formadoras de colônias viáveis por amostra, conforme descrito anteriormente. Este gráfico mostra o número de unidades formadoras de colônias em biofilmes preparados utilizando o reator de disco rotativo e expostos ao peróxido de hidrogênio, demonstrando a capacidade de produzir até 18 biofilmes idênticos. O uso do reator de disco rotativo torna esta técnica ideal para testes de compostos antimicrobianos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como operar biofilmes em reatores de fluxo gotejado e em reatores de disco rotativo. Esses reatores de biofilme oferecem alternativas aos biofilmes em células de fluxo e em placas de microtitulação, sendo ideais quando é necessário uma grande quantidade de biomassa de biofilme ou quando se deseja realizar testes antimicrobianos em biofilmes estabelecidos.