Assistida por computador visualização de grande escala e Quantificação da Missa das ilhotas pancreáticas, distribuição de tamanho e Arquitetura

O objetivo geral deste procedimento é coletar dados representativos imparciais dentro de uma amostra limitada e analisar com precisão a complexa estrutura tridimensional do tecido. Isso é realizado primeiramente capturando fatias virtuais de seções pancreáticas imunohistoquimicamente coradas. Em seguida, as fatias virtuais são quantificadas com a macro de fatia virtual IHC no software ImageJ, e os dados são analisados com scripts escritos para o Mathematica.

Em seguida, é realizada uma reconstrução 3D das fatias virtuais utilizando o ImageJ. O passo final do procedimento consiste em capturar uma pilha de imagens individuais de ilhotas usando o software Slide Book e mapear manualmente as pilhas de imagens em três dimensões com o Stereo Investigator. Em última análise, é possível obter uma arquitetura precisa das ilhotas com coordenadas tridimensionais para cada célula das ilhotas por meio de um método combinado de imagem 3D e mapeamento manual. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de estudos da obesidade e diabetes, como a forma pela qual condições fisiológicas e patofisiológicas afetam a distribuição e a arquitetura das ilhotas pancreáticas e a massa das células beta.

As implicações desta técnica estendem-se ao diagnóstico ou terapia da obesidade e da melitose diabética, pois uma melhor compreensão das alterações na massa de células beta facilitará o desenvolvimento e a avaliação de intervenções terapêuticas. Embora os métodos descritos no presente estudo forneçam especificamente informações sobre a análise imuno-histoquímica dinâmica do pâncreas, eles também podem ser aplicados a uma variedade de outros organismos e tecidos. A demonstração visual deste método é fundamental, pois as etapas de análise assistida por computador são difíceis de aprender.

Devido à complexidade da análise de conjuntos de dados tão grandes em duas e três dimensões. Inicie este procedimento colocando uma lâmina limpa contendo uma seção inteira de um pâncreas imunohistoquimicamente corado no suporte de um microscópio fluorescente. Abra o software Stereo Investigator e visualize a amostra clicando em aquisição.

E então a imagem em tempo real. Determine os níveis de exposição para cada canal utilizando a janela do histograma de vídeo, que exibe a intensidade da fluorescência. Neste exemplo, o canal dois é usado para DAP P, o canal três para GFP, o canal quatro para RFP, o canal cinco para sci cinco e o canal seis para SCI sete.

Usando a janela de configurações da câmera, ajuste o nível de exposição para que a intensidade da fluorescência diminua. No extremo direito do histograma do vídeo, a imagem pode ser focalizada com a roda de foco do microscópio. Antes de criar uma fatia virtual, delimite a amostra clicando na tela em um ponto afastado da amostra, o que marcará um ponto de referência.

Em seguida, clique ao redor do contorno da amostra quando o contorno estiver completo. Clique com o botão direito e selecione fechar contorno para conectar os pontos inicial e final; uma vez fechado o contorno, capture uma fatia virtual da amostra selecionando aquisição e, em seguida, adquira a fatia virtual. Quando as opções da janela de fatia virtual forem abertas, selecione aquisição em alta velocidade, bem como desative o modo manual.

Foque desmarcando a caixa ao lado de manual. Salve o arquivo. Calibre o prefo clicando com o botão direito e selecionando adicionar à lista de sites de foco.

Foque manualmente várias seções aleatórias na visualização prévia do corte virtual. Quando várias áreas tiverem sido focadas, inicie o corte virtual clicando com o botão direito e selecionando. Inicie o corte virtual com prefo; após a conclusão do corte virtual para a primeira amostra, mude para o próximo canal e ajuste a exposição conforme necessário. Esse procedimento é repetido para cada canal a fim de realizar a quantificação dos olhinhos. Processe as imagens utilizando uma macro do ImageJ denominada I-H-C-V-S, que primeiramente prepara as imagens carregadas para análise e então quantifica características dos olhinhos, como composição celular.

Os macros I-H-C-V-S separam a pilha em seus respectivos canais de cor. No ImageJ, converte cada imagem em uma máscara preta e branca de oito bits. Após o limiar automático de intensidade, soma aritmeticamente as imagens dos canais separados em uma máscara composta.

A análise de partículas embutida no Image J na imagem composta identificará então regiões de interesse ou ROIs, excluindo ao mesmo tempo partículas menores que uma célula beta. A quantificação das ROIs. O uso do Image J produz uma planilha com parâmetros celulares.

Salve os resultados agregados em uma planilha do Excel. Armazene dados como área, perímetro, circularidade, diâmetro fer, centro do ilhó e os respectivos números identificados na imagem. A análise computacional desses parâmetros pode ser realizada conforme descrito no protocolo escrito. Para obter informações como distribuição e análise de frequência dos ilhós, realize a reconstrução 3D de cortes virtuais executando um script que converte todas as imagens JP2 do diretório em arquivos TIF, formato utilizado na construção e quantificação de pilhas tridimensionais a partir dos cortes virtuais.

Aqui, um script chamado I MJ dois dois tiff é utilizado. Copie o script para o diretório que contém as imagens JP dois. Execute o script com o shell do Linux digitando ponto barra I am JP dois dois TIFF no console e, em seguida, pressionando enter.

Quando todas as imagens capturadas tiverem sido convertidas de JP2 para arquivos TIFF, estarão prontas para serem usadas na análise no ImageJ. Usando o ImageJ, abra todas as imagens da primeira amostra, que neste caso são de um pâncreas fetal humano, e combine-as em uma única imagem selecionando imagem, cor e, em seguida, mesclar canais. Repita este processo para cada uma das amostras. Quando todas as amostras tiverem sido combinadas em imagens individuais, limpe as imagens selecionando regiões indesejadas com a ferramenta de seleção poligonal.

Preencha-os selecionando editar e, em seguida, preencher. Converta cada imagem em uma imagem colorida RGB. Por fim, crie uma pilha com as imagens, após o que elas podem ser alinhadas com o plugin stack reg.

No final, a fusão dos canais e a combinação das imagens criam um mosaico tridimensional de todas as ilhotas no pâncreas inteiro. Para coletar pilhas de imagens, posicione as ilhotas pancreáticas montadas inteiras sob o microscópio. Aplique água se estiver usando uma objetiva de imersão em água.

Abra o software do slide book, acesse a captura e o controle de foco pressionando controle mais shift mais E na janela de controle de foco. Defina a objetiva para 20 vezes ou 40 vezes, dependendo do tamanho do orifício. Para usar a ocular do microscópio para localizar os orifícios, defina o bin para duas vezes e o conjunto de filtros para usuário um.

No painel de controle de foco, a seleção de emissão deve ser ajustada para 100%Eyes, a densidade neutra deve ser definida em um clique para GFP ey, e então abrir o piso para visualizar a amostra no slide book; retorne ao painel de controle de foco e mude o conjunto de filtros para fixo. Em seguida, clique em G-F-P-D-S. Use o joystick para centralizar o orifício na janela da câmera o mais precisamente possível.

Focalize em uma profundidade próxima ao centro do orifício, onde as células possam ser facilmente discernidas. Na janela de controle de foco, selecione o zab. Use o controle do microscópio para rolar até a profundidade mais superior do orifício na qual os detalhes possam ser claramente discernidos e clique em definir superior.

Role até a parte inferior do olhal e clique em definir. Clique na parte inferior para avançar. Para retornar ao ponto de referência na janela de captura, clique em avançado e depois em alternar para o modo de canal.

Defina o fator de agrupamento como duas vezes e o tipo de captura como 3D no lado direito da janela, clique em usar posições superior e inferior e retorne ao volume central após a captura. Defina o tamanho do passo como três. Defina o conjunto de filtros como live abaixo da caixa do conjunto de filtros.

Selecione DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U e SCI cinco DSU. Para cada um, clique em encontrar o melhor em ajustar exposição. Em seguida, clique em teste para garantir que a exposição selecionada seja adequada.

Clique em iniciar para começar a captura. Quando a captura for concluída, ajuste os níveis conforme necessário e altere a cor exibida para RFP para branco. Salve a lâmina e vá para visualizar exportação da série TIFF.

Digite o nome do lâmina com um traço no final e salve-o. Dezenas de arquivos individuais no formato TIF são criados, portanto pode ser útil manter cada pilha de imagens dos orifícios em uma pasta separada. Para mapear as pilhas de imagens, abra o software Stereo Investigator.

Visualize a imagem abrindo as pilhas de imagens no menu de escala de imagem. Defina a distância entre as imagens como três mícrons para corrigir a dobra duas vezes. No slide book, selecione substituir as escalas X e Y e use um valor especificado para a origem das escalas X e Y.

Digite 0,65 para os centros X e Y e aumente o zoom na imagem clicando no botão de zoom e, em seguida, no centro do ilhote de interesse na janela macro, marque pelo menos uma célula. Usando o marcador apropriado, as células beta aparecerão verdes. As células alfa aparecerão vermelhas e as células delta aparecerão brancas.

Marque as células no centro de seu núcleo, que aparecerão azuis se a amostra tiver sido corada com DPI. Use o marcador dois para marcar as células beta. O marcador cinco para marcar as células alfa e o marcador seis para marcar as células delta. Após pelo menos uma célula ter sido marcada, exiba a vista ortogonal usando o ícone no menu superior, marque o filtro Z e a opção simétrico.

O intervalo deve ser definido como 15,00. Começando no Z 0,0, percorra os orifícios utilizando a roda do mouse e marque cada célula com o marcador apropriado, marcando cada célula apenas uma vez no centro de sua profundidade. Após concluir a marcação de cada nível de Z, a caixa de seleção do filtro Z pode ser desmarcada.

Isso mostrará todos os marcadores de todos os níveis de Z. Quando todas as células tiverem sido marcadas, salve o arquivo como um arquivo DAT. Em seguida, vá até exportar rastreamento no arquivo.

Salve o rastreamento como um arquivo TXT. Por fim, clique em novo arquivo de dados para limpar a área de trabalho antes de tentar mapear novos ilhotes. A preparação de fatias virtuais a partir de uma amostra de pâncreas corada por imuno-histoquímica permite a análise das células endócrinas alfa, beta e delta em todo o pâncreas em conjunto como ilhotas; a coloração imuno-histoquímica para insulina pode ser vista em verde, glucagon em vermelho, somatostatina em branco e dap em azul.

As imagens foram então convertidas em uma máscara de oito bits após o limiar automático. É mostrada aqui a imagem composta sobreposta. No entanto, a distribuição de ilhós usando fatia virtual também permite análise individual em canais separados.

Aqui, as visualizações de cada canal são mostradas para revelar as células delta, células beta e células alfa. A análise de partículas é realizada sobre uma máscara composta, mostrando cada estrutura de olhete numerada e destacada em azul. A análise de partículas das máscaras compostas é gerada como uma tabela de dados contendo parâmetros como área da ilha, perímetro, circularidade e vários diâmetros para cada olhete detectado, os quais possuem IDs que correspondem às marcações numeradas na máscara composta.

A análise em larga escala dessas imagens resulta na produção de histogramas do número total de ilhótas e da distribuição de tamanho, bem como em comparações detalhadas das áreas das células alfa, beta e delta. O mapeamento de ilhotas e a análise matemática da composição celular e arquitetura podem revelar um único plano focal a partir de uma pilha de imagens reconstruída em 3D de ilhotas humanas carregadas no Stereo Investigator. Aqui, as células beta estão em verde, as células alfa em vermelho, as células delta em branco e os núcleos em azul.

Após a captura de eyelets distintos, as células alfa, beta e delta são marcadas em diversos planos horizontais aqui, sendo apresentadas imagens fluorescentes e os dados dos mapas correspondentes para três planos focais diferentes com intervalo de 10 mícrons. Uma vez que as células alfa, beta e delta tenham sido marcadas em vários planos, o eyelet pode ser visualizado em 3D. É mostrada aqui uma reconstrução tridimensional do eyelet cortado em quarto, com base nas coordenadas obtidas pelo mapeamento do eyelet.

Além disso, a análise matemática automatizada dos olhinhos mapeados pode exibir a composição e arquitetura celulares. Aqui, mostra-se a frequência relativa das distâncias entre células dentro de uma única população celular. Também é mostrada a frequência relativa das distâncias entre células de duas populações celulares diferentes.

Também são mostradas as probabilidades cumulativas das distribuições de distância entre célula e célula para células alfa a alfa, beta a beta e delta a delta. O teste de Kolmogorov-Smirnov (KS) pode ser realizado nessas probabilidades para obter as distâncias KS correspondentes. Após dominar a técnica, a obtenção de imagens e análise em larga escala de uma seção tecidual inteira podem ser realizadas em quatro horas.

A reconstrução 3D de um bloco de tecido pode ser realizada em 30 minutos. Por fim, a imagem 3D e o mapeamento manual podem ser concluídos em quatro horas, se realizados corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante começar com uma coloração imuno-histoquímica de alta qualidade das seções.

A precisão da análise subsequente dependerá inteiramente dos dados brutos. Além disso, certifique-se de que seus computadores tenham pelo menos oito gigabytes de RAM para processar essa análise em larga escala após o seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores, não apenas na área de obesidade e diabetes, mas amplamente em muitos outros campos que utilizam a análise patológica padrão.

Pode ser particularmente útil quando a disponibilidade de amostras é limitada. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como coletar dados representativos imparciais dentro de um tamanho amostral limitado, utilizando técnicas padrão. Selecionar apenas uma região específica pode não ser representativo do conjunto geral, como demonstramos em nosso estudo sobre a distribuição de ilhotas pancreáticas.