Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli

O objetivo geral deste procedimento é criar uma biblioteca de mutantes aleatórios para uma sequência de DNA alvo específica e identificar e caracterizar rapidamente os mutantes utilizando uma seleção funcional semi-quantitativa. Isso é realizado primeiramente transformando um plasmídeo com uma origem de replicação contendo a sequência alvo na linhagem mutadora coli. Após o plaqueamento e incubação das células durante a noite, elas são colhidas e o plasmídeo alvo é isolado para obter a biblioteca de mutantes; em seguida, a biblioteca de mutantes é transformada em uma linhagem repórter para caracterizar as mutações na segunda parte do protocolo. Uma placa de crescimento em gradiente é montada e culturas bacterianas da linhagem repórter são inoculadas em uma placa de Petri separada contendo ágar mole.

O passo final do procedimento é carimbar e transferir essas culturas bacterianas para o gradiente. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram alterações no perfil fenotípico de uma sequência-alvo específica por meio de diferenças no crescimento em um gradiente de fármaco. Este vídeo apresenta um método para a evolução direcionada de proteínas em *E. coli*.

Esse processo imita a evolução natural na geração de bibliotecas aleatórias de nutrientes, seguida por uma seleção que restringe essa diversidade. Assim, melhora nossa capacidade de gerar novas atividades bioquímicas para fins industriais ou biomédicos. Este procedimento possui duas componentes: a geração de uma biblioteca mutante aleatória e a seleção funcional para obter mutações com ganho de função. A demonstração deste procedimento será feita por Jennifer Allen, uma técnica do meu laboratório.

Antes do início deste protocolo, células eletrocompetentes JS200 expressando uma variante de baixa fidelidade da DNA polimerase uma ou polimerase de baixa fidelidade, uma, que foram previamente preparadas conforme descrito no protocolo escrito, essas células contêm um alelo termossensível da polimerase uma, de modo que a atividade da polimerase de baixa fidelidade predomina a 37 graus Celsius, construa um plasmídeo alvo contendo uma origem de replicação de coli, uma, com a sequência alvo clonada adjacente à origem de replicação. A polimerase de baixa fidelidade inicia a replicação do plasmídeo coli, uma, introduzindo assim mutações para iniciar a mutagênese.

Combine 40 microlitros de células eletrocompetentes e entre 30 e 250 nanogramas de DNA plasmidial alvo em uma lacuna de dois milímetros. Realize a eletroporação com pulso vet, misturando a solução na eletroporadora a 1800 volts. Verifique a constante de tempo ou TC para garantir condições uniformes de ativação para cada amostra.

Idealmente, TC equivale a cinco a seis milissegundos. Deixe a mistura de DNA celular recuperar em um mililitro de caldo LB durante 40 minutos a 37 °C sob agitação a 250 RPM. Obtenha uma placa de Petri LV agro de 100 milímetros pré-aquecida a 37 graus Celsius, contendo antibióticos apropriados para seleção de ambos os plasmídeos, e plaque as células recuperadas em uma diluição apropriada para obter uma concentração próxima à de um gramado, definida como um número distinto, porém incontável, de colônias, conforme mostrado neste exemplo.

Após incubação durante a noite, colete as colônias bacterianas das placas de Petri com caldo LB. Isole o plasmídeo, o DNA das células coletadas; o plasmídeo resultante constitui a biblioteca de mutantes aleatórios.

Realize uma digestão por restrição cortando a biblioteca de plasmídeos com uma enzima de restrição que linearize tanto o plasmídeo alvo quanto o polo. Em um plasmídeo, execute um gel analítico de aro no DNA plasmidial isolado para confirmar a qualidade e a quantidade. Após a verificação dos plasmídeos, digira um micrograma da biblioteca com uma enzima de restrição que linearize o plasmídeo do polo, mas não corte o plasmídeo alvo.

Após a digestão com enzima de restrição ser concluída, purifique a biblioteca utilizando um kit de purificação de DNA. Por fim, transforme a biblioteca purificada em uma linhagem repórter para caracterizar as mutações. Para iniciar o preparo do gradiente, marque 10 faixas espaçadas uniformemente ao longo de uma borda da base da placa de Petri quadrada.

Coloque a placa em uma inclinação de modo que a borda inferior marcada fique elevada sete milímetros. Despeje 25 mililitros de ágar LB morno, misturado bem com uma concentração apropriada do agente seletivo, na placa inclinada. Esta é a camada inferior do gradiente.

Certifique-se de que o ágar LB recobre a placa de Petri de modo que a extremidade elevada marcada da placa contenha aproximadamente um milímetro de ágar LB, e a parte inferior contenha cerca de oito milímetros. Tampe a placa com a tampa KU para ventilação e deixe o ágar solidificar por 10 a 15 minutos. Após a camada inferior de ágar LB ter endurecido, transfira a placa para uma superfície plana.

Em seguida, despeje 25 mililitros de ágar LB morno sem o agente seletivo para recobrir a superfície do primeiro ágar, certificando-se de cobrir toda a camada inferior. Tampe a placa com a tampa KU para ventilação e, então, deixe o ágar solidificar por 10 a 15 minutos para realizar a transferência por carimbo das bactérias. Primeiro, obtenha culturas bacterianas da linhagem repórter e dilua-as para apresentar densidades celulares idênticas, com uma densidade óptica a 600 nanômetros inferior a 1,0.

Em seguida, transfira dois mililitros de ágar-ágar líquido em equilíbrio a 42 graus celsius para o fundo de uma placa de Petri redonda de 100 milímetros, pipete 40 microlitros da cultura bacteriana para dentro do ágar-ágar mais macio e, então, misture movimentando suavemente a placa. Revesta a borda longa da lâmina de microscópio de vidro com a mistura de ágar-ágar mais macio. Em seguida, alinhe a borda revestida da lâmina com a marca inferior no recipiente com gradiente.

Toque a lâmina na superfície do ágar. Um toque suave é suficiente para transferir uma fita do ágar macio para a superfície do gradiente. Em seguida, a lâmina é colocada de lado para limpeza e reutilização.

Repita este processo. As amostras restantes e os controles experimentais devem ser incluídos em cada placa com gradiente. Se vários gradientes estiverem sendo utilizados, incube a placa com gradiente virada para baixo durante a noite a 37 graus Celsius. Os tempos e temperaturas de incubação podem variar para diferentes cepas bacterianas de leitura, mas a incubação durante a noite a 37 graus Celsius geralmente é suficiente para o crescimento visível.

Por fim, obtenha imagens e analise o crescimento celular conforme descrito no protocolo escrito. Abaixo estão imagens de uma linhagem repórter transformada com P-G-F-U-V não mutado ou com uma biblioteca mutante de PG FPUV que foram submetidas ao processo. Após quatro rodadas de mutagênese, colônias escuras ou fracas indicam plasmídeos contendo mutações que inativam a GFP.

Esta figura representa a frequência de mutações ao longo da sequência neutra do plasmídeo alvo em intervalos de 100 pares de bases. Observe que as mutações ocorrem em toda a sequência do plasmídeo, mas com maior frequência próximo à origem de replicação. Aqui, o crescimento de mutantes é mostrado em um gradiente de droga.

A distância crescida em direção ao topo do gradiente indica o perfil diferencial de resistência à droga entre os mutantes. Neste exemplo, bibliotecas de plasmídeos da desmetilase oxidativa humana ABH dois foram triadas em busca de mutantes com resistência aumentada ao metil metano sulfonato, utilizando gradientes de seleção com drogas. Duas. Tais bibliotecas, representando duas e quatro iterações do protocolo de mutagênese, são mostradas em comparação com o tipo selvagem parental e o vetor vazio.

A linha branca denota o limite acima do qual colônias mutantes individuais foram isoladas. Para análise fenotípica adicional, mutantes da beta-lactamase, R 1 64 H e E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, previamente identificados utilizando mutagênese P um com baixa fidelidade e seleção astri e m, são mostrados em 0,4 micrograma por mililitro e em quatro microgramas por mililitro. A proteção conferida pelo gradiente de cefotaxima contra a cefotaxima é indicativa de atividade de beta-lactamase de espectro estendido.

Observe que a enzima beta-lactamase do tipo selvagem não confere proteção em relação às células que expressam um vetor vazio. Portanto, esses mutantes representam uma adaptação ou a evolução de uma nova atividade bioquímica. Aqui apresentamos uma combinação poderosa de mutagênese e seleção funcional para a geração dessas novas atividades bioquímicas.

Uma seleção funcional pode ser obtida por meio de seleção com drogas ou por complementação genética, aproveitando nossa capacidade de gerar grande diversidade genética. A patogênese pode precisar ser restrita a uma sequência específica para otimizar atividades proteicas preexistentes ou para patogênese direcionada a sítios. Isso pode ser facilmente realizado por clonagem.

Além disso, a mutagênese pode ser desacoplada de uma seleção funcional para obter ataques característicos ou pegadas mutacionais.