Levedura Método Embedding Colony
22 de março de 2011
Um método para a incorporação de colônias de leveduras permitindo o corte de microscopia óptica e eletrônica. Este protocolo permite a determinação da distribuição de células esporuladas e células pseudohyphal dentro colônias fornecendo uma nova ferramenta para a compreensão da organização de tipos de células dentro de uma comunidade de fungos.
O objetivo geral deste procedimento é embutir colônias de levedura. Isso é realizado primeiramente removendo uma colônia e o ágar subjacente de uma placa de ágar, colocando-a sobre várias gotas de ágar fundido e cobrindo rapidamente com mais ágar fundido. Em seguida, o excesso de ÁGAR é cortado da colônia para torná-la pequena o suficiente para caber em um molde.
A colônia embutida na AER é então fixada, corada, desidratada e, finalmente, infiltrada com resina spurs. O bloco é então colocado em um molde com resina spurs adicional e incubado até endurecer, sendo posteriormente seccionado. Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram a distribuição dos tipos celulares dentro de uma colônia de levedura por meio de microscopia óptica ou eletrônica.
A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia eletrônica de varredura, é que ela permite determinar a estrutura interna da colônia. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do desenvolvimento microbiano, como a distribuição de tipos celulares dentro das colônias. Este método forneceu informações sobre a estrutura de colônias croce CAC, mas é provável que também possa ser aplicado a outros microrganismos.
A demonstração visual deste método é essencial, já que o manuseio e a inclusão de colônias podem ser difíceis de aprender a partir de um protocolo escrito. A ideia para este método surgiu de alguns dados genéticos que publicamos em 2002, os quais sugeriam que esporos não estavam distribuídos uniformemente nas colônias. Adaptamos um método para seccionamento de colônias que foi desenvolvido por engelberg no laboratório fin.
Então vamos começar. Incube inicialmente leveduras do tipo selvagem de S. visi em placas com ágar a 30 graus até que haja aproximadamente 300 colônias. Usando uma espátula fina, remova colônias de diâmetro de um a dois milímetros, uma por vez, da placa.
Em seguida, utilizando a ponteira de uma pipeta de um mililitro, coloque várias gotas de ágar a 2% a 42 graus Celsius sobre uma lâmina de microscopia e, imediatamente, posicione a colônia sobre o ágar com a face voltada para cima, antes que o ágar solidifique. Adicione várias gotas adicionais de ágar sobre a colônia e deixe o ágar solidificar, garantindo que toda a colônia, incluindo seu topo, fique envolvida pelo ágar. Em todos os passos subsequentes do protocolo, utilize uma lâmina de barbear.
Recorte o AER ao redor da colônia e coloque o bloco de AER contendo a colônia. Em um frasco de vidro com tampa rosqueável de 3,5 mililitros contendo fixador de 2% paraformaldeído e 2% glutaraldeído, as colônias devem ser processadas, uma de cada vez para evitar secagem, mas até 10 colônias podem ser colocadas no mesmo frasco. Deixe as colônias por sete dias a quatro graus Celsius.
Após uma semana, remova o fixador e lave as colônias agri duas vezes, usando aproximadamente 1,5 mililitros de cloreto de sódio 0,15 molar, com pH ajustado para 7,2, e incube em gelo após cada lavagem por 15 minutos sem agitação. Após isso, realize mais duas lavagens.
Utilizando 1,5 mililitros de um tampão X OS, composto por fosfato monoácido de potássio 100 milimolar, cloreto de magnésio 10 milimolar, pH 6,0, incubar no gelo por cinco minutos após cada lavagem. Em seguida, utilizando o mesmo frasco, realizar o tratamento com ósmio e as lavagens listadas aqui e na parte escrita deste protocolo. Depois novamente, utilizando o mesmo frasco, realizar as desidratações progressivas listadas aqui e no protocolo escrito acompanhante no início da manhã seguinte.
Prepare o reagente spurs conforme mostrado aqui e no protocolo escrito acompanhante. Lave imediatamente os blocos de agri cinco vezes, durante 10 minutos cada, com 1,5 mililitros de etanol a 100% em temperatura ambiente. Após a última lavagem com etanol, remova apenas o suficiente de etanol para que o bloco de agri permaneça coberto.
Usando pipeta de pasteur, coloque aproximadamente 0,5 mililitros do reagente spurs no vial e gire em uma roda a baixa velocidade por 15 minutos. Em temperatura ambiente após a rotação, deixe o vial em repouso por 30 minutos. Em seguida, remova completamente a solução.
Em seguida, adicione 1,5 mililitros do reagente spurs para cobrir o bloco agri. Novamente, gire o frasco em uma roda durante 15 minutos à temperatura ambiente e deixe em repouso por 30 minutos. Repita esta lavagem.
Repita o passo mais três vezes. Após os últimos 30 minutos, remova o reagente spurs e adicione reagente spurs fresco para cobrir os blocos. Deixe os blocos de agri em repouso à temperatura ambiente por quatro horas.
Substitua o reagente spurs e gire durante a noite. Na manhã seguinte, substitua o reagente spurs e deixe os frascos girando até o dia seguinte. Na manhã posterior, coloque o reagente spurs em moldes de silicone numerados, cobrindo apenas o fundo dos moldes.
Em seguida, coloque os blocos de ágar nas moldes e incube a 60 graus Celsius por quatro horas. Após quatro horas, complete as moldes com mais espessuras, reagente e incube a 60 graus Celsius durante a noite. Remova os blocos das moldes para o corte em seções.
Um exemplo de micrografia luminosa de uma seção através do centro de uma colônia de levedura Wild S Visia é mostrado aqui. Esta levedura é uma linhagem selvagem isolada de exsudatos de árvores. A colônia foi incubada por seis dias em meio YNA antes da seção.
Nesta imagem, asai, hyphy pseudoficada e levedura ovoide são facilmente distinguíveis e a região da colônia que invade o ágar subjacente também é aparente. Setas abertas indicam asai representativas; setas preenchidas indicam células vegetativas ovoides representativas; pontas de seta preenchidas indicam cadeias de células alongadas e si. Esta imagem é um exemplo de micrografia eletrônica de uma seção fina de uma linhagem de laboratório de levedura SH 1 0 2 0 e W 3 0 3. Fundamento.
A colônia foi incubada por seis dias em meio YNA antes do corte. A imagem mostra uma região da colônia contendo alta frequência de células esporuladas. Uma seta indica a estrutura em bicamada da parede do esporo.
Na parte A, mostramos uma seção de uma colônia de quatro dias com uma grade composta por 15 retângulos sobreposta à imagem na parte B. A frequência de células relacionadas a esporos em cada retângulo é representada graficamente com 15 barras correspondentes aos 15 retângulos mostrados na parte A. Os dados são a média e o erro padrão de quatro colônias independentes de quatro dias. Na parte C, são apresentadas as médias e os erros padrão de quatro colônias independentes de oito dias. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas semanas, com um dia inteiro e vários dias de uma a três horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de adicionar as soluções imediatamente para que os blocos não sequem após seguir este procedimento.
Outros métodos, como a microscopia eletrônica imunológica, poderiam possivelmente ser usados para determinar a distribuição de células que expressam proteínas específicas após seu desenvolvimento. Esta técnica permitiu-nos observar não apenas o padrão de células esporuladas, mas também o padrão de células pseudo-hifais em colônias croce CCI. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como embutir colônias de levedura para seccionamento.
Não se esqueça de que muitos dos reagentes de microscopia utilizados neste protocolo podem ser extremamente perigosos. Lembre-se de usar uma capela de exaustão, usar roupas de proteção e descartar os reagentes adequadamente. Ok, é isso.
Obrigado por assistir. Boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para embutir colônias de levedura, permitindo o corte em seções para microscopia óptica e eletrônica. O protocolo facilita a análise de células esporuladas e pseudofilamentosas dentro das colônias, contribuindo para a compreensão da organização dos tipos celulares em comunidades fúngicas.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Biologia Celular
- Biologia Fúngica
Antecedentes
- As colônias de levedura exibem diversos tipos celulares.
- Compreender a distribuição celular é crucial para estudar comunidades fúngicas.
- Métodos tradicionais podem não fornecer informações detalhadas sobre a organização celular.
- Este método oferece uma nova abordagem para visualização.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para o inclusão de colônias de levedura.
- Permitir a análise detalhada da distribuição de tipos celulares.
- Aprimorar a compreensão da organização de comunidades fúngicas.
Métodos Utilizados
- Remoção de colônias de levedura de placas de ágar.
- Inclusão de colônias em ágar fundido.
- Recorte do ágar excedente para ajuste aos moldes.
- Fixação, coloração, desidratação e infiltração com resina.
Resultados Principais
- Embebição bem-sucedida de colônias de levedura para microscopia.
- Visualização de células esporuladas e pseudofilamentosas.
- Análise detalhada da distribuição de tipos celulares dentro das colônias.
- Novas perspectivas sobre a organização de comunidades fúngicas.
Conclusões
- O método de inclusão é eficaz para análise por microscopia.
- Ele fornece uma ferramenta valiosa para o estudo da estrutura de colônias de levedura.
- Pesquisas futuras podem se basear neste método para explorar interações fúngicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender a organização espacial dos tipos celulares dentro de comunidades microbianas auxilia na validação de alvos na descoberta de agentes antimicrobianos e antifúngicos. Este método permite a redução de riscos mecanicistas ao revelar a heterogeneidade fenotípica que pode influenciar a resposta ao fármaco e o desenvolvimento de resistência. Ele fornece confiança preditiva para triagem em estágios iniciais ao associar a arquitetura da colônia a subpopulações funcionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização da distribuição de células esporuladas e pseudofilamentosas dentro de colônias.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da observação direta do padrão de tipos celulares associado a estados funcionais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, preservando as relações espaciais dos tipos celulares.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio do corte e imagem consistentes das estruturas internas da colônia.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Discute a relevância da doença por meio da visualização de regiões de colônia invasora que modelam a penetração microbiana nos tecidos do hospedeiro.
- Valor Operacional: Descreve a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo a correlação estrutural com desfechos fenotípicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Posiciona o método na fase inicial de descoberta para a identificação de compostos ativos, ao permitir o fenotipamento estrutural que orienta as decisões de triagem de compostos.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método apoia o teste de hipóteses e a elucidação de vias por meio da imagem direta da distribuição assimétrica de células.
- Triagem: Descreve a preparação do ensaio mediante a produção de cortes espessos e finos compatíveis com microscopia óptica e eletrônica.
- Análises: Destaca resultados quantitativos, como o mapeamento da frequência de células esporuladas nas diferentes regiões da colônia, para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método à continuidade pré-clínica ao associar as bordas invasivas das colônias a modelos de penetração tecidual.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável para análise estrutural em múltiplas linhagens fúngicas e condições.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista no comportamento de comunidades microbianas.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade do preparo de colônias para fluxos de trabalho de microscopia multiusuário.
- Valor Estratégico: Tomada de decisões mais eficaz sobre prosseguir ou interromper projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados por meio da desconsideração precoce de riscos fenotípicos.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base em biomarcadores estruturais de virulência ou persistência.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica necessária em histologia, microscopia e manipulação microbiana.
- Necessidades de instrumentação e infraestrutura analítica, incluindo micrótomos, microscópios ópticos e eletrônicos e sistemas de infiltração com resina.
- Requisitos de padronização entre equipes para protocolos de fixação, coloração e corte entre grupos de microbiologia e de imagem.
- Considerações de adaptação entre sistemas modelo, como bactérias formadoras de biofilme ou outras espécies de leveduras com morfologia de colônia variável.
- Limitações práticas apoiadas pelo material de origem, incluindo restrições de tamanho de colônia (diâmetro de 1-2 mm) e tempo de processamento de vários dias, exigindo técnica estéril para prevenir contaminação.
