Uma ferramenta analítica-box para avaliação bioquímica, estrutural e Transcriptoma abrangente de Biofilmes Oral Mediada por estreptococos do grupo mutans

Os biofilmes formados nas superfícies dentárias são altamente complexos e estruturados. Comunidades microbianas envoltas em uma matriz extracelular, expostas a desafios ambientais constantes. O objetivo geral aqui é apresentar dois componentes específicos de uma caixa de ferramentas analítica projetada para facilitar estudos estruturais e moleculares, considerando a natureza complexa dos biofilmes orais, combinando uma nova técnica de imagem de fluorescência com um software personalizado para processamento e análise de dados.

Isso é realizado primeiramente pela seleção de ensaios específicos para análise de biofilme, transcriptoma e estrutura, incluindo uma nova abordagem de imagem confocal para visualização simultânea de EPS e bactérias. O segundo passo do procedimento é coletar os dados brutos dos bioensaios. O terceiro passo é processar os dados brutos utilizando softwares específicos, incluindo o duo stat recém-desenvolvido para análise de colocalização.

O passo final é analisar os dados do processo, incluindo o uso de mineração de dados de microarranjo e software de organização de microarranjos, visualizador de dados ou MDV. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram como os patógenos orais alteram seu transcriptoma e a arquitetura dos biofilmes em resposta à dieta complexa e às interações microbianas do hospedeiro, utilizando nossa caixa de ferramentas analítica exclusivamente integrada, proporcionando uma análise de biofilme e interpretação de dados mais abrangentes. Olá, meu nome é Michelle Kuh, professora associada no centro de biologia oral aqui no Centro Médico da Universidade de Rochester.

Hoje, apresentamos uma caixa de ferramentas analítica para análise de biofilmes. Essa caixa de ferramentas pode ajudar a responder perguntas-chave na área de pesquisa de biofilmes, como a estruturação das células do biofilme, seu arranjo com a matriz extracelular e como elas respondem a desafios ambientais complexos no nível transcriptômico. Meu nome é Jean, ela, sou pesquisadora pós-doutoranda no laboratório da Dra. K.

Hoje vou demonstrar a parte de imagem da nossa caixa de ferramentas. Olá, sou Aise Klein. Sou professora assistente de pesquisa no laboratório do Dr. Ks.

Hoje, apresentarei o software MDV para análise de dados de microrray. Neste procedimento, discos de hidroxiapatita revestidos com saliva são utilizados como substitutos da superfície dentária, nos quais biofilmes são cultivados. Primeiro, adicione 2,8 mililitros de meio de cultura inoculado com S. mutants em cada poço de uma placa de 24 poços, protegendo a placa da luz, e adicione o corante LOR 6 47 conjugado com dextrina a cada poço até uma concentração final de um micromolar, pipetando para cima e para baixo várias vezes para misturar o corante ao meio de cultura.

Em seguida, utilizando pinças estéreis, mergulhe e lave os discos de hidroxiapatita recobertos com saliva estéril duas vezes em tampão AB estéril para remover qualquer excesso de saliva ou componentes salivares não ligados. Depois, posicione os discos verticalmente no meio de cultura suplementado com corante, garantindo que cada disco fique completamente submerso. Cubra a placa com folha de alumínio e incube-a a 37 graus Celsius em uma estufa com 5% de dióxido de carbono por 20 horas para permitir a formação dos biofilmes e a incorporaçãdo do corante conjugado aos exopolissacarídeos produzidos pelas células bacterianas.

Para rotular primeiro as células bacterianas, prepare uma placa de 24 poços com 2,8 mililitros de água estéril milli Q por poço. Adicione 1,5 microlitro de corante citocina a cada poço para uma concentração final de um micromolar e proteja a placa da luz. Uma vez formado o biofilme, remova a placa contendo os discos do incubador e mergulhe.

Lave cada disco em uma solução de cloreto de sódio a 0,89%. Em seguida, transfira-os para a nova placa contendo o corante citocina. Cubra a placa com folha de alumínio e incube por 30 minutos à temperatura ambiente.

Uma vez que as células tenham sido coradas, mergulhe, lave os biofilmes e o cloreto de sódio como antes. Em seguida, utilizando pinças, solte os biofilmes do fio para dentro de uma placa de Petri contendo cloreto de sódio. Envolva a placa de Petri com papel alumínio.

Os biofilmes estão agora prontos para visualização por microscopia confocal utilizando um microscópio confocal de varredura a laser. Analise cada biofilme em cinco a dez posições selecionadas aleatoriamente e gere séries Z em cada posição. Para permitir reconstruções tridimensionais, abra as imagens confocais e processe-as utilizando um software espelho.

Esta renderização tridimensional de imagens confocais produzida usando o programa Amira mostra um biofilme de mutantes S formado sobre uma superfície apática utilizando o procedimento demonstrado. Células bacterianas e microcolônias são visíveis em verde e estão embutidas na matriz do biofilme contendo exopolissacarídeos. Em vermelho, pode ser gerada uma vista ampliada de uma área selecionada, que ilustra a relação estrutural específica entre bactérias e EPS em escala microscópica.

Utilize o programa duos stat para quantificar a quantidade de colocalização de componentes separados do biofilme, como as bactérias e os polissacarídeos exocelulares. Primeiro, configure o caminho do duos stat recém-desenvolvido no MATLAB versão 5.1 e abra as pastas de imagens contendo as séries Z das imagens dos dois componentes do biofilme. Em seguida, escolha dois canais que serão correlacionados e analisados.

As duas pilhas de imagens devem ter tamanhos de pixel idênticos em todas as dimensões e o mesmo número de imagens em cada pilha. Defina os limiares para cada canal e siga as instruções na interface do software, inserindo os dados no arquivo de processamento de dados para análise. Esta figura mostra como a pilha dupla interpreta quantitativamente a relação espacial entre bactérias e DBS.

No interior do biofilme, o Duo Stack calcula a distribuição vertical de bactérias e EPS desde a superfície do disco até a fase fluida, conforme visto aqui na linha verde para bactérias e na linha vermelha para EPS. Ele também calcula a colocalização de bactérias e EPS ao longo da espessura do biofilme. Conforme mostrado na linha amarela, os dados revelam proporções mais elevadas de EPS do que de bactérias ao longo da profundidade do biofilme, e a maioria das células bacterianas está associada ao EPS, especialmente nas camadas médias e superiores. O Duo Stat com renderização 3D proporciona uma compreensão aprimorada da organização estrutural e das interações entre bactérias e EPS em biofilmes.

Para garantir que se obtenha RNA de alta qualidade a partir de biofilmes, recomendamos que a extração de RNA seja realizada de acordo com o protocolo específico para biofilmes descrito no artigo de Curian KU publicado em 2007. Na revista, protocolos-padrão da bioquímica analítica são utilizados para a preparação de microarranjos de DNA e ensaios de PCR quantitativo em tempo real. Para facilitar a análise dos grandes conjuntos de dados gerados por experimentos de microarranjo, desenvolvemos um software de mineração e organização de dados, o visualizador de dados de microarranjo ou MDV, que está disponível on-line em www.oralgen.anl.gov.

Antes de enviar os dados ao MDV, realize uma análise estatística como um teste T pareado com modelo de variância aleatória utilizando o software BRB Array Tools disponível online, com um valor de corte P de 0,001 para comparação de classes. Neste exemplo, realizou-se a análise de biofilmes de S. mutans cultivados em três concentrações distintas de açúcar e quatro pontos temporais. Foram realizadas comparações pareadas, gerando três arquivos BRB: condição A, 0,5% de sacarose mais 1% de amido versus 1% de sacarose; condição B, 0,5% de sacarose mais 1% de amido versus 0,5% de sacarose; e condição C, 0,5% de sacarose versus 1% de sacarose.

Este painel representa o número de genes detectados como diferencialmente expressos em cada condição e ponto temporal avaliado por meio de comparação de classes padrão utilizando a ferramenta BRB Array, o que resulta em um grande número de genes denominados dados brutos BRB. Para demonstração do MDV, focaremos no ponto temporal de 30 horas utilizando o Excel. Converta os dados brutos BRB em arquivos de texto separados por tabulação MDV.

Certifique-se de remover todas as letras que acompanham o número da guia do locus gênico, por exemplo, no nome SMU dot 1432 C. Exclua a letra C, abra o MDV. Abra o menu arquivo e escolha selecionar fonte de anotação. Selecione a opção de arquivo plano quando uma caixa de diálogo aparecer.

Use os botões de navegação para escolher os arquivos que contêm anotações para dados de classificação funcional de vias por número de ontologia genética e nome do gene. Vá até o arquivo e importe cada um dos arquivos convertidos para o formato MDV. Cada arquivo representa uma condição experimental.

Compare os genes expressos em cada condição experimental A versus B versus C. Neste exemplo, utilizando o recurso do diagrama de Venn. Para esta demonstração, focamos nos genes diferencialmente expressos que estão exclusivamente relacionados às influências da sacarose e do amido em combinação. O recurso baseado no diagrama de Venn é usado para visualizar o número de genes únicos e compartilhados expressos sob essas diferentes condições e nos auxilia na identificação daqueles que devem ser selecionados para análises posteriores.

Aqui, selecionamos apenas os genes expressos diferencialmente que são exclusivos da condição A e/ou B, mas não aqueles detectados em C, conforme mostrado em cinza aqui. O MDV reduziu drasticamente o número total de genes a serem analisados e, ao mesmo tempo, filtrou os genes não relevantes para o caso experimental. No menu arquivo, escolha a opção exportar para salvar os dados.

Como arquivos limitados por tabulações, os arquivos podem então ser abertos no Excel, onde a saída de dados pode ser organizada e convertida nas exibições gráficas desejadas. A organização dos dados no Excel permite a exibição gráfica da saída de VDM. Este gráfico mostra uma visão geral da expressão diferencial de subconjuntos funcionais únicos de genes que são afetados pela combinação de amido e sacarose em estágios distintos do desenvolvimento do biofilme.

As influências no transcriptoma dos mutantes S são mais acentuadas após 30 horas de desenvolvimento do biofilme do que em outros pontos temporais. Os resultados nos ajudaram a identificar com precisão subconjuntos funcionais específicos de genes relevantes para nossa hipótese de trabalho, considerando os efeitos temporais, o que facilitou a seleção de genes e o processo de validação subsequente. Após este procedimento, métodos bioquímicos e proteômicos também podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais são as respostas fisiológicas e metabólicas específicas dos organismos dentro dos biofilmes.

Essa análise abrangente e integrada certamente ajudaria a compreender melhor como os biofilmes modulam a patogenicidade em cavidades internas, um ambiente altamente dinâmico e complexo. Para mais detalhes, consulte o arquivo PDF anexado a este artigo em vídeo.