Visualização melhorada e Análise Quantitativa dos Efeitos de Drogas Usando Células micropatterned

O objetivo geral do procedimento a seguir é demonstrar como a normalização da arquitetura celular e da posição, alcançada por meio de padrões microscópicos adesivos específicos, permite a automação fácil da aquisição de imagens e um processamento direto das imagens com quantificação sensível e robusta dos efeitos de fármacos, o que é inatingível em lâminas de vidro convencionais. Isso é conseguido ao semear células heli em chips SI dois que possuem padrões microscópicos em forma de L rotulados SI três. As células adotam uma forma triangular, formando uma fibra de estresse principal que se estende entre as duas extremidades do L. Em seguida, as células padronizadas são incubadas com lebos statina ou mantidas sem tratamento, fixadas e coradas para visualizar o citoesqueleto de actina e os núcleos.

As imagens das células micropadronizadas são então adquiridas e processadas usando a macro cell ref para gerar uma pilha de imagens para análise e a macro hypotenuse para quantificar fenótipos. Em última instância, podem ser obtidos resultados que mostram um efeito significativo de doses baixas de estatina BLEs em células HELOC micropadronizadas, o qual é indetectável em condições padrão de cultivo celular. Olá, seja bem-vindo.

Estamos aqui hoje para guiá-lo pelo nosso protocolo experimental, explicando como utilizar padrões microscópicos adesivos para análise celular, além de mostrar dados experimentais que ilustram a fácil quantificação de doses muito baixas de fármacos nesses padrões microscópicos adesivos. Assim, ao observar pela primeira vez esses padrões microscópicos, você compreenderá imediatamente como eles podem resolver problemas de variabilidade na captura de imagens durante a análise celular. Pois, ao dispor de uma verdadeira matriz de células, semelhante a um microarranjo, é possível mover facilmente a platina do microscópio de uma célula para outra, permitindo capturar imagens de maneira sequencial.

Mas essa é claro não é a única vantagem que os micropadrões oferecem. Eles proporcionam muitas outras melhorias, pois, de fato, em certos micropadrões típicos, como o cruzado ou o em Y, estamos normalizando a arquitetura interna da célula, ou seja, organelas, o fuso mitótico, o citoesqueleto e as diferentes redes proteicas estão todas nas mesmas localizações de célula para célula ou na mesma orientação de célula para célula, o que torna muito mais fácil prever e quantificar os efeitos de fármacos sobre esses padrões específicos. Isso pode parecer bastante contraintuitivo em comparação com o que normalmente é feito no clássico bico de Petri ou microplaca.

Bem, porque você frequentemente observa, é claro, células se movendo e adotando diferentes morfologias. Enquanto que nos microdesenhos adesivos, todas as células começarão a se parecer, pois estão respondendo a esse microdesenho adesivo e organizando sua arquitetura da mesma maneira. Isso pode parecer, de fato, um pouco artificial, mas quando se analisa mais atentamente, o prato de Petri não é ainda mais artificial?

Porque nos tecidos, as células são limitadas pelas células vizinhas, bem como pela matriz extracelular. Assim, recebem muita informação espacial, que orienta a arquitetura celular. E essa adaptação local a padrões microscópicos é o que estamos fazendo.

Estamos restaurando essa informação espacial às células e todas as células estão respondendo a isso e se organizando da mesma maneira. E agora, como todas as células se parecem, podemos introduzir o conceito de célula de referência, o que significa que podemos fazer a média de todas as imagens e obter uma única imagem, que é realmente representativa da aparência da célula em uma condição específica. Em seguida, você pode adicionar uma droga e observar novamente a célula de referência para ver como a morfologia ou a organização celular foi modificada em resposta àquela droga.

Coloque dois chips situ two individualmente em dois poços independentes de uma placa de seis poços, garantindo que o logotipo situ two esteja legível. Os chips situ two utilizados neste experimento possuem microdesenhos corados com FibroGen SI three e devem ser mantidos no escuro antes do uso. Colete células hela com aproximadamente 80% de confluência utilizando tripsina e verifique se estão adequadamente individualizadas ao microscópio. Centrifugue a 300 ×g durante quatro minutos e ressuspenda suavemente as células. Conte e dilua as células até uma concentração de 15.000 células por mililitro.

Em meio de cultura D-M-E-M-F 12 incompleto, distribua 60.000 células por poço. A placa deve ser movida o mínimo possível para evitar introduzir movimentos de rotação no meio, o que tenderá a concentrar as células no centro. Deixe as células sedimentarem por 10 minutos sob a câmara de fluxo laminar e, em seguida, transfira-as para o incubador de células.

Em 10 a 20 minutos no incubador celular, as células começarão a aderir após 10 minutos; verifique regularmente ao microscópio quando as células tiverem se fixado. Troque o meio celular e remova o excesso de células repetindo o seguinte procedimento quatro vezes. Mantendo a placa plana, aspire suavemente o meio do lado do poço.

Tomar cuidado para manter quantidade suficiente de meio e evitar que o chip seque. Adicionar quatro mililitros de PBS e aspirar começando pelo centro do chip. Em seguida, mover para a lateral do poço para aspirar a maior parte do PBS como antes, e verificar ao microscópio a presença de células flutuantes.

Se permanecer uma grande quantidade de células em suspensão, repita o procedimento de lavagem. Se houver muito poucas células, aspire parte do PBS e substitua por dois mililitros de meio fresco, aspire novamente e adicione quatro mililitros de meio fresco duas vezes. Incube as células por três horas em uma incubadora de células para permitir que as células se espalhem completamente.

Utilizando este método, entre 10 e 30% dos microdesenhos estarão ocupados por uma única célula, enquanto outros desenhos estarão vazios ou ocupados por múltiplas células. Para tratar as células com a solução diluída de estatina BLEs, dilua a solução estoque do fármaco de 17 milimolar até uma concentração final de cinco micromolar com 0,1% de DMSO em quatro mililitros de meio. Para o controle, prepare o meio contendo apenas 0,1% de DMSO, aspire o meio celular e substitua-o rapidamente pelas soluções de estatina BLEs ou de controle para evitar que o chip seque.

Incube as células por uma hora a 37 graus Celsius. Durante essa incubação, prepare o tampão de citoesqueleto. Adicione um grama de sacarose a dois mililitros de cb.

Isso ajuda a preservar as estruturas celulares internas. Misture um mililitro de sacarose CB com quatro mililitros de PFA a 5%. Adicione dois mililitros de PFA na solução de sacarose CB.

Em dois poços de uma placa fresca de seis poços. Para fixar as células, use pinças para pegar o chip CY2 e coloque-o na placa de seis poços contendo dois mililitros de PFA em solução de sacarose CB. Incube as células por 10 minutos à temperatura ambiente, remova o PFA e lave as células uma vez com PBS, depois lave as células com dois mililitros de cloreto de amônio 100 milimolar por 10 minutos.

Para inibir a atividade residual de reticulação com PFA, permeabilize as células adicionando dois mililitros de PBS contendo 0,1% de Triton X-100 por três minutos, lave duas vezes com PBS e marque os filamentos de actina com dois mililitros de fain conjugado com ZI na diluição de 1 para 2000 em PBS com 1,5% de BSA, incubando por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, lave as células uma vez com dois mililitros de PBS. A seguir, contraia os núcleos.

Adicione dois mililitros de um miligrama por mililitro de hawked em PBS e incube por três minutos à temperatura ambiente. Lave duas vezes com dois mililitros de PBS. Monte os dois chips laterais em uma lâmina padrão usando de 25 a 30 microlitros de soluções de montagem, como al.

Para adquirir imagens em três comprimentos de onda, utilizamos o software de imagem Metamorph e um microscópio NIK icon eclipse T. Equipado com a câmera CCD Hema Matsu e um iluminador de fibra de mercúrio Intens Lite. Primeiro, selecione a ampliação de 20x.

A seguir, na barra de menu, abra a aquisição multidimensional para configurar os diferentes parâmetros do experimento. Primeiro, indique onde salvar seus dados.

Defina o número de comprimentos de onda como três, selecione os três comprimentos de onda do SI e posicione a lâmina com lamínula de modo que 12 micro padrões fiquem centralizados no campo da câmera. O número de micro padrões visualizados por campo variará conforme as configurações da câmera e dos objetivos. Ajuste o tempo de exposição para cada comprimento de onda e o foco automático.

Para o PS três, crie um jornal executando a aquisição multidimensional e salve-o como MDA jnl. Abra a função de varredura da platina para adquirir 24 imagens, cada uma contendo 12 micro padrões. Insira seis colunas e quatro linhas com tamanho de passo x de menos 400 mícrons e tamanho de passo y de 300 mícrons em definir jornal para executar, carregue o jornal MDA jnl e pressione varredura para iniciar a aquisição automatizada das 24 imagens nos três comprimentos de onda.

Neste vídeo, padrões microscópicos em forma de L são utilizados para induzir a formação de uma única fibra principal de actina que sustenta a parte da célula não aderida, simplificando a visualização e a mensuração do impacto das estatinas sobre as células, em comparação com células assentadas sobre fibronectina comum. Para o processamento e análise automatizados de imagens, descrevemos dois macros personalizados desenvolvidos para o programa de código aberto ImageJ; a partir de uma pilha de imagens brutas, o primeiro macro extrai células individuais e cria uma célula de referência. O segundo macro mede o colapso da membrana celular.

O primeiro passo é a segmentação de células individuais a partir de imagens brutas. As imagens do micropadrão marcadas com fluorescência são utilizadas para delimitar regiões centradas nos micropadrões, que são recortadas nas imagens para cada comprimento de onda e novamente montadas em pilhas (stacks) para cada comprimento de onda. Para selecionar micropadrões com uma única célula, a macro detecta o número de núcleos por imagem e elimina, em todas as pilhas, aquelas que contêm mais de um núcleo ou nenhum núcleo.

Por fim, o plugin multi-stack reg do ImageJ é utilizado para realinhar todas as imagens coletadas e todos os canais com base na posição do micropadrão. Esta etapa gera pilhas de linhas de imagens individuais que agora podem ser usadas para análise de célula única ou para criar uma célula de referência. No ImageJ, a célula de referência é construída fazendo uma projeção das imagens filtradas e alinhadas a partir de uma pilha.

Vários métodos de projeção podem ser aplicados, mas geralmente é escolhida uma projeção mediana para eliminar valores discrepantes da pilha de imagens. A célula de referência é uma ferramenta única e útil para representação e análise de imagens, obtida apenas com células de micropadrão. Para facilitar seu exame, é aplicada uma tabela de consulta ou LUT para converter a imagem monocromática em um mapa de frequência codificado.

Para caracterizar o efeito da estatina nas BLEs, a rigidez e o colapso da célula foram analisados usando uma macro do Image J. Resumidamente, imagens com limiar definido do padrão micro L são usadas para definir uma hipotenusa teórica da forma triangular da célula. Em seguida, realiza-se o limiar nas imagens da marcação de actina para definir a forma da célula.

A diferença na área entre a hipotenusa teórica e a membrana celular côncava real é então medida; as células que apresentam uma área abaixo da hipotenusa teórica são consideradas colapsadas. O impacto da estatina BLEs em cinco micromolar foi caracterizado comparando-se o número de células colapsadas nas condições tratadas e controle. Imagens típicas de células com micropadrão L tratadas com estatina BLEs ou deixadas sem tratamento são mostradas; as células foram fixadas e coradas em micropadrões.

A actina e os núcleos são mostradas em vermelho, verde e azul, respectivamente. Observe o impacto do estatina BLEs na forma celular em comparação com as condições controle. Células representativas após incubação com estatina BLEs ou controles em fibronectina simples são mostradas aqui.

As células foram fixadas e coradas, sendo o actina e os núcleos mostrados em verde e azul, respectivamente. Observe a semelhança entre as condições tratadas e controladas. São apresentadas imagens típicas de células de referência obtidas de células tratadas com estatina BLEs ou deixadas sem tratamento.

Observe o potencial desta abordagem para a fácil observação do fenótipo em estudo. A seguir, temos um exemplo de análise dos efeitos do estatina BLEs sobre células utilizando a macro-hipotenusa. Enquanto 25% das células controle estavam colapsadas, esse valor triplicou para 75% nas células tratadas com estatina BLEs a cinco micromolar, refletindo a rede contrátil de actinina enfraquecida.

Após assistir a isso, você agora deverá ter uma boa compreensão de como os padrões microadesivos resolvem vários gargalos na análise de alto conteúdo. Primeiro, o uso de padrões microadesivos tornou a captura de imagens, o processamento e a análise muito mais simples. Segundo, os padrões microestruturados permitem a detecção de efeitos muito sutis de fármacos em doses muito baixas, pois se reduz a variabilidade entre células ao normalizar sua morfologia e seu comportamento.

E finalmente, em comparação com os milhares de células normalmente necessários para obter um bom resultado na análise celular, você precisa apenas de algumas dezenas de células para obter um resultado robusto e significativo utilizando nossa célula de referência.