Métodos para a transferência rápida e localização de Patógenos Doença de Lyme no intestino Tick
14 de fevereiro de 2011
Estudos de pesquisa a doença de Lyme muitas vezes exigem a geração de carrapatos infectados com o patógeno Borrelia burgdorferi, um processo que normalmente leva várias semanas. Aqui nós demonstramos uma microinjeção baseado procedimento de infecção do carrapato que pode ser realizado em poucas horas. Nós também demonstramos um método de imunofluorescência para na localização in situ de B. burgdorferi dentro de carrapatos.
O objetivo geral deste procedimento é microinjetar e localizar células de Borrelia burgdorferi no intestino do carrapato. Isso é realizado primeiramente preparando as agulhas capilares de vidro e preenchendo-as com células de B. burgdorferi. Em seguida, as células de B. burgdorferi são transferidas para o intestino do carrapato por meio de microinjeção.
Em seguida, o carrapato é dissecado e os tecidos intestinais são removidos. Por fim, é realizada a marcação por imunofluorescência de beberg defer no intestino do carrapato. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a localização de beberg em ferry no intestino do carrapato utilizando microscopia confocal.
Olá, sou a Dra. Ruth Paul Paul, professora assistente na Universidade de Maryland, no Departamento de Medicina Veterinária. Hoje, dois membros do meu laboratório, Toro Cairo, pesquisador pós-doutorando, e Adam Coleman, aluno de pós-graduação, irão mostrar o procedimento de infecção artificial de carrapatos por microinjeção que realizamos rotineiramente no laboratório. Após a microinjeção, dissecaremos o carrapato e visualizaremos as bactérias no intestino do carrapato utilizando microscópio confocal CE.
A principal vantagem da microinjeção em carrapatos para geração de carrapatos naturalmente infectados é a duração do procedimento. A microinjeção reduz todo o processo de semanas para horas, já que aproximadamente cinco semanas são necessárias para gerar carrapatos infectados por meio do processo natural de alimentação. Esta técnica também pode ser adaptada para injetar outros reagentes úteis, como RNA de fita dupla para RNAi ou anticorpos para interferência específica de anticorpos no interior do carrapato.
Para começar, fabrique várias agulhas de microinjeção aquecendo e puxando tubos capilares de vidro de um milímetro em um aparelho para puxar micropipetas de vidro. Remova cuidadosamente os tubos capilares frágeis. Armazene as agulhas reunidas com a ponta voltada para cima sobre fita adesiva em uma placa de Petri.
Em seguida, cultive B. burgdorferi em meio BSK até uma concentração de aproximadamente 10⁷ células por mililitro. Peline B. burgdorferi por centrifugação a 3000 × g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e ressuspenda completamente o pellet no meio BSK, passando suavemente através de uma micropipeta estéril de 200 µL, até uma concentração final de 10⁹ células por mililitro.
Como as células são ressuspendidas em alta densidade celular e podem se aglomerar, a suspensão celular deve ser usada imediatamente para microinjeção para preparar os carrapatos; coloque uma fita adesiva transparente de dupla face em uma lâmina de vidro trabalhando sobre um tapete adesivo, remova cuidadosamente os carrapatos do recipiente. Usando um pincel pequeno, posicione o número necessário de carrapatos a serem injetados na fita adesiva com o lado ventral voltado para cima, todos voltados na mesma direção. Carregue cinco microlitros da cultura de beberg de ferry na agulha de capilar reunida. Usando uma ponta de pipeta microload de 20 microlitros, inspecione a agulha em busca de bolhas de ar aprisionadas e recarregue a agulha com a cultura bacteriana.
Se necessário, visualize o carrapato sob o microscópio estereoscópico e foque na região do ânus do carrapato. Toque suavemente a ponta da agulha capilar para quebrar o tubo na região onde o diâmetro é ligeiramente menor que o do ânus do carrapato, formando a agulha de microinjeção. Este passo é crítico, pois qualquer tentativa de injetar carrapatos com pontas de agulha inadequadas causa lesões e possível morte.
Para o carrapato injetado. Coloque os carrapatos imobilizados sob o microscópio estereoscópico e foque na abertura anal, que é coberta por duas placas anais móveis. Usando pinças finas, toque suavemente e aplique pressão muito leve em qualquer área próxima à abertura anal.
Isso permitirá a separação das placas anais e a abertura do poro anal que se conecta ao intestino. Insira cuidadosamente a ponta da agulha levemente na abertura anal através da separação forçada das placas anais. A inserção da agulha deve ser mantida no mínimo, pois a ponta de vidro poderá danificar o intestino posterior semitransparente que se conecta ao reto.
Usando um microinjetor equipado com controle automático de pedal, injete a solução de beberg de ferry utilizando os seguintes parâmetros: pressão de injeção de 1000 hectopascals, tempo de injeção de 0,2 segundos e pressão de compensação de oito hectopascals. Cada ovo recebe uma única injeção após a microinjeção.
O carrapato deve apresentar sinais de movimento ou rastejar em resposta a estímulos semelhantes aos anteriores à injeção. Para dissecar carrapatos para microscopia de imunofluorescência, coloque primeiro uma gota de solução salina tamponada com fosfato em uma lâmina de vidro limpa para a dissecação e outra gota em uma lâmina revestida com poli-L-lisina. Para microscopia, prepare outra lâmina de vidro com fita adesiva dupla face. Em seguida, retire o carrapato do recipiente e coloque-o sobre a fita adesiva dupla face.
Usando um pincel pequeno sob a visão do microscópio de dissecção, foque no carrapato e posicione uma lâmina de barbear afiada sobre o carrapato entre o primeiro e o segundo par de patas. Pressione firmemente, cortando o carrapato em duas partes, expondo o abdômen, que deve ser imediatamente submerso em uma gota de PBS usando pinças finas. Segure o exoesqueleto dorsal e ventral ao redor do local do corte.
Puxe cuidadosamente o escudo dorsal para cima e para longe do carrapato, expondo o divertículo intestinal de coloração acastanhada. Tenha cuidado para manter os carrapatos em dissecção imersos em PBS o tempo todo. Os feixes de glândulas salivares semitranslúcidos estão localizados em ambos os lados da região anterior do intestino e podem ser removidos neste momento, se desejado.
Segurando o exoesqueleto restante com pinça, retire cuidadosamente o intestino do abdômen. Limpe com cuidado o intestino removendo quaisquer tecidos aprisionados, como as traqueias. Usando a ponta de uma pinça fina, transfira rapidamente o intestino do carrapato para uma gota de PBS em uma lâmina de vidro revestida com poli-L-lisina.
Seccione o intestino em pedaços menores usando lâminas finas ou pressionando suavemente com a ponta de pinças finas. Aspire cuidadosamente o excesso de PBS ao redor dos tecidos intestinais. Deixe os tecidos intestinais secarem ao ar em temperatura ambiente.
Fixe o intestino do carrapato mergulhando-o em acetona por 10 minutos. Deixe secar ao ar à temperatura ambiente; as lâminas podem ser armazenadas nesta etapa por meses a menos 20 graus Celsius em um recipiente hermético. Para a marcação por imunofluorescência do intestino, desenhe um círculo ao redor do intestino fixado do carrapato com uma caneta Pap ou outro dispositivo formador de barreira hidrofóbica.
Isso ajudará a reter as soluções de coloração durante as etapas subsequentes de incubação. Cubra o intestino do carrapato com uma ou algumas gotas de tampão bloqueador por 30 minutos, em temperatura ambiente.
O soro utilizado para bloqueio depende da origem do animal hospedeiro do anticorpo. Não permita que a lâmina seque a partir deste ponto. Aspire lentamente o tampão de bloqueio.
Incube o intestino com soluções apropriadas de anticorpos primários e/ou secundários. Utilizamos anticorpo anti-B berg marcado com fluoresceína isotiocianato ou FXI. Incube o anticorpo em uma diluição de um para 100 no tampão de bloqueio durante uma hora.
A temperatura ambiente, cubra o recipiente com papel alumínio para limitar a exposição à luz. Remova a solução de anticorpo por aspiração suave. Incube o intestino com um corante fluorescente para marcar tecidos do carrapato, como DPI ou iodeto de propídio.
Normalmente utilizamos 20 microgramas por mililitro de iodeto de peridíneo em PBS durante cinco minutos à temperatura ambiente, lavamos três vezes com tween 20 0,05% em PBS durante cinco minutos. Por fim, montamos a lâmina em glicerol tamponado contendo um reagente Antifa e cobrimos cuidadosamente com uma lamínula. As lâminas podem ser armazenadas nesta etapa por alguns meses a quatro graus Celsius em um recipiente hermético, e a imagem e a localização de b berg de ferry são analisadas em um microscópio confocal.
Uma microinjeção em carrapato é mostrada aqui com uma agulha preenchida com azul brilhante kumasi para fins de visibilidade. Uma pinça fina é usada para aplicar pressão suave ao corpo, o que permite a separação das placas anais e a abertura do poro anal para a microinjeção. Aqui, a região anterior de um divertículo intestinal é mostrada com beberg ferry no interior do intestino.
Os núcleos intestinais e as espiroquetas são marcados com iodeto de propídio ou com anti-Beberg Ferry conjugado à Fitzy, respectivamente. Após dominar a técnica, descobrimos que 10 carrapatos podem ser microinjetados com sucesso, resultando naturalmente em cerca de cem mil organismos sobreviventes e infectados com Fer. Embora os carrapatos possam ser usados imediatamente em outros experimentos, geralmente aguardamos um ou dois dias para garantir que os carrapatos sobrevivam ao procedimento antes de prosseguir.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar carrapatos artificialmente infectados por meio de micro e barreira localizada de microrganismos dentro do intestino do carrapato, utilizando imunofluorescência confocal. Trabalhar com carrapatos e finas agulhas de vidro preenchidas com um patógeno humano, como Borrelia burgdorferi, pode ser perigoso. Esteja atento às localizações dos carrapatos e das agulhas e pratique, em todos os momentos, as precauções de nível dois de biossegurança.
Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método baseado em microinjeção para infectar carrapatos com Borrelia burgdorferi, reduzindo significativamente o tempo necessário para a infecção dos carrapatos. Além disso, demonstra-se uma técnica de imunofluorescência para localizar o patógeno nos tecidos dos carrapatos.
Principais Componentes do Estudo
Área de Ciência
- Microbiologia
- Biologia de vetores
- Localização de patógenos
Antecedentes
- A doença de Lyme é causada pela bactéria Borrelia burgdorferi.
- Os carrapatos são os vetores primários para a transmissão desse patógeno.
- Métodos tradicionais para infectar carrapatos são demorados.
- Métodos de infecção rápida podem aumentar a eficiência da pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método mais rápido para infectar carrapatos com B. burgdorferi.
- Permitir a localização in situ do patógeno nos tecidos dos carrapatos.
- Melhorar a compreensão das interações entre carrapatos e patógenos.
Métodos Utilizados
- Preparação de agulhas de capilar de vidro para microinjeção.
- Microinjeção de células de B. burgdorferi no intestino do carrapato.
- Dissecação de carrapatos para isolamento dos tecidos intestinais.
- Marcação por imunofluorescência de B. burgdorferi em tecidos intestinais.
Resultados Principais
- Microinjeção bem-sucedida de B. burgdorferi nos intestinos dos carrapatos.
- Localização eficaz do patógeno demonstrada por imunofluorescência.
- Resultados visualizados utilizando microscopia confocal.
- O método reduz significativamente o tempo necessário para infecção dos carrapatos.
Conclusões
- A técnica de microinjeção é uma alternativa viável para infecção de carrapatos.
- A imunofluorescência permite a localização precisa de patógenos.
- Essa abordagem pode facilitar pesquisas futuras sobre a transmissão da doença de Lyme.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A infecção rápida e controlada de vetores carrapatos com Borrelia burgdorferi permite o estudo eficiente das interações patógeno-vetor essenciais para a pesquisa da doença de Lyme. Essa abordagem de microinjeção reduz os períodos de infecção de semanas para horas, apoiando triagem de alto rendimento e desvio mecanicista no estágio inicial de descoberta. O método fornece entrega reprodutível do patógeno, aumentando a confiança preditiva na validação de alvos e nos fluxos de trabalho de desenvolvimento de ensaios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar as interações entre Borrelia burgdorferi e o intestino do carrapato para validar alvos terapêuticos envolvidos na persistência e transmissão do patógeno.
- Valor Operacional: Fornece cargas padronizadas de patógenos em coortes de carrapatos, reduzindo a variabilidade em modelos de infecção e melhorando a reprodutibilidade dos ensaios.
- Valor Preditivo: Apoia a desmistificação funcional de alvos ao permitir exposição controlada a cepas de patógenos, incluindo aquelas atenuadas em modelos murinos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera tecidos de carrapatos infectados adequados para ensaios de imunofluorescência e microscopia confocal posteriores, a fim de quantificar a localização e a carga do patógeno.
- Valor Operacional: Produz resultados quantificáveis e prontos para microscopia, permitindo a padronização das leituras de detecção de patógenos em campanhas de triagem.
- Escalabilidade: Facilita a preparação de grande número de carrapatos uniformemente infectados, apoiando a reprodutibilidade do ensaio e a reutilização da plataforma em sistemas de triagem baseados em vetores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Fornece um sistema relevante para a doença no estudo da localização de Borrelia burgdorferi no intestino do carrapato, conectando achados in vitro à fisiopatologia baseada no vetor.
- Redução de Riscos Mecanística: Permite a visualização da distribuição do patógeno nos tecidos do carrapato, orientando hipóteses sobre fatores de virulência específicos de tecidos e mecanismos de transmissão.
- Aprimoramento de Modelo Pré-clínico: Apoia decisões de avanço com ajuste de risco ao fornecer exposição consistente ao patógeno para avaliação da eficácia de intervenções em modelos de doenças transmitidas por carrapatos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a avaliação pré-clínica, permitindo a geração rápida de vetores carrapatos infectados e leituras padronizadas da localização do patógeno.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre interações patógeno-vetor ao fornecer quantidades controladas de Borrelia burgdorferi ao intestino do carrapato para investigação mecanicista.
- Triagem: Produz tecidos de carrapatos padronizados e infectados, adequados para ensaios quantitativos de imunofluorescência, aumentando a reprodutibilidade nos fluxos de trabalho de detecção de patógenos.
- Análises: Gera leituras baseadas em microscopia confocal da localização e carga do patógeno, permitindo análise comparativa entre condições experimentais e intervenções.
- Pesquisa Translacional: Conecta o cultivo in vitro de patógenos à localização no tecido do carrapato, apoiando o alinhamento de biomarcadores e a relevância fisiopatológica em modelos de doenças transmitidas por vetores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para infecção de carrapatos com diversos agentes biológicos, incluindo anticorpos e reagentes de RNAi, ampliando a aplicabilidade além dos estudos com Borrelia burgdorferi.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas interações patógeno-vetor por meio da detecção localizada de patógenos.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade dos modelos de infecção em carrapatos, reduzindo o tempo e o investimento de recursos em comparação com métodos naturais de alimentação.
- Valor Estratégico: Aprimora a eficiência das decisões de avançar ou interromper no estágio inicial de descoberta, fornecendo modelos padronizados e rápidos de exposição a patógenos para reduzir riscos em alvos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de iniciativas de pesquisa sobre a doença de Lyme por meio de modelos de infecção confiáveis e de alta fidelidade que reduzem a variabilidade biológica.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em técnicas de microinjeção, manipulação de carrapatos e microscopia confocal por imunofluorescência.
- Depende da preparação de agulhas capilares de vidro, instrumentação de microinjetores e infraestrutura de microscopia de fluorescência.
- Necessita padronização dos parâmetros de injeção e protocolos de dissecação intestinal entre equipes para garantir entrega consistente do patógeno e leituras confiáveis de localização.
- A adaptação a diferentes espécies de carrapatos ou cepas de patógenos pode exigir otimização do tamanho da agulha, pressão de injeção e concentração bacteriana.
- As limitações práticas incluem a habilidade técnica necessária para microinjeção bem-sucedida e dissecação intestinal, bem como a necessidade de contenção em nível biosseguro 2 ao manipular patógenos humanos.
