Polietileno Glicol eficiente Transformação Mediada (PEG) do Moss Physcomitrella patens
19 de abril de 2011
Um método simples e eficiente para transformar Physcomitrella pantens Protoplastos é descrito. Este método é adaptado de protocolos para Physocmitrella Protonemal protoplastos e Arabidopsis Transformação de protoplastos do mesófilo 1.
O objetivo geral deste procedimento é transformar protoplastos de SCO Metre. Isso é realizado primeiramente digerindo as plantas com Drizly. Em seguida, os protoplastos são lavados com manitol para remover o Drizly e, então, incubados com DNA e PEG.
Por fim, os protoplastos transformados são espalhados em placas e incubados. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram protoplastos transformados expressando proteínas marcadas com fluorescência por meio de microscopia de fluorescência. Demonstrará o procedimento Y lu, um pós-doutorando do meu laboratório.
A principal vantagem desta técnica é que ela é eficaz e gera consistentemente protoplastos que expressam a proteína de interesse. Para isolar protoplastos de musgo, comece adicionando nove mililitros de manitol a 8% em uma placa de Petri usando uma espátula. Coloque musgo com cinco a sete dias de idade, proveniente de duas a três placas PP NH quatro, no manitol. Consulte o protocolo escrito acompanhante para este e outros preparos de reagentes. Em seguida, adicione três mililitros de drizly a 2% e incube à temperatura ambiente com agitação suave por uma hora.
Filtre a mistura através de uma malha de 100 microns para obter uma suspensão homogênea verde. Em seguida, centrifugue o filtrado a 250 G durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante com muito cuidado.
Resuspenda os protoplastos em 500 microlitros de manitol a 8%. Em seguida, adicione mais 9,5 mililitros de manitol a 8%. Certifique-se de que os protoplastos estejam completamente suspensos.
Realize os passos de lavagem mais duas vezes, centrifugando novamente a solução a 250 G por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os protoplastos primeiro em 500 microlitros.
Em seguida, 9,5 mililitros de manitol 8% utilizando um hemocitômetro. Conte o número de protoplastos em 10 microlitros da suspensão para transformar o DNA nos protoplastos isolados. Primeiro, centrifugue a mistura de protoplastos a 250 ×g durante cinco minutos.
Remova o sobrenadante e ressuspenda os protoplastos a 1,6 milhão por mililitro em solução MMG. Incube a suspensão à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, adicione 600 microlitros da solução de protoplastos a um tubo de cultura contendo 60 microgramas de DNA. Agite.
Adicione cuidadosamente 700 microlitros de solução de PEG com cloreto de cálcio e agite. Incube bem a amostra à temperatura ambiente por 30 minutos durante este período de espera. Cubra as placas de PRMB com papel celofane.
Em seguida, dilua a suspensão com três mililitros da solução W5 e centrifugue a 250 ×g durante cinco minutos. Para remover o PEG, re-suspenda os protoplastos em dois mililitros de meio PRMT e plaque um mililitro por placa PRMB coberta com celofane. Mantenha as placas a 25 graus Celsius em uma câmara de crescimento.
Finalmente, quatro dias após a transformação, transfira a celulose para placas de seleção frescas. Esta figura mostra um exemplo de plantas com 18 dias de idade regeneradas a partir de protoplastos, transformados com 15 microgramas de plasmídeo superenrolado, DNA, contendo um cassete de resistência à higromicina. Aqui, 30 microgramas do mesmo plasmídeo superenrolado, DNA, foram transformados em protoplastos.
60 microgramas de DNA xadrez foram transformados nesta amostra. E, finalmente, essas plantas foram regeneradas a partir de protoplastos que foram transformados com 120 microgramas do mesmo DNA plasmidial superenrolado contendo o cassete de resistência à higromicina. A eficiência de transformação não é afetada por concentrações de DNA de até 60 microgramas.
No entanto, concentrações mais elevadas de DNA são prejudiciais a este procedimento. Os dados indicam que este método fornece resultados consistentes em uma ampla faixa de quantidades de DNA por semestre. Esta técnica pode ser realizada em três horas, se for executada corretamente.
Após este procedimento, métodos adicionais como RNAi transitório e interrupção gênica podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a função gênica.
Visão Geral
Este artigo descreve um método simples e eficiente para transformar protoplastos de Physcomitrella patens. A técnica é adaptada de protocolos existentes para transformação de protoplastos e tem como objetivo produzir resultados consistentemente bem-sucedidos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Vegetal
- Engenharia Genética
- Biologia Celular
Antecedentes
- Protoplastos são células vegetais com suas paredes celulares removidas.
- Técnicas de transformação são essenciais para estudar a função gênica em plantas.
- Physcomitrella patens atua como organismo modelo na pesquisa vegetal.
- Métodos existentes para transformação de protoplastos podem ser complexos e demorados.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo simplificado para a transformação de protoplastos de Physcomidrella patens.
- Aumentar a eficiência e a confiabilidade da transformação de protoplastos.
- Facilitar estudos genéticos adicionais em musgos.
Métodos Utilizados
- Digerir tecido de musgo com Drizly para isolar protoplastos.
- Lavar protoplastos com manitol para remover contaminantes.
- Transformar protoplastos isolados com DNA utilizando PEG.
- Incubar protoplastos transformados em meio seletivo.
Resultados Principais
- Os protoplastos transformados expressaram com sucesso proteínas fluorescentes.
- O método apresentou eficiência de transformação consistente em diversas concentrações de DNA.
- Constatou-se que concentrações mais altas de DNA são prejudiciais ao sucesso da transformação.
- O procedimento inteiro pode ser concluído em aproximadamente três horas.
Conclusões
- Este método fornece uma abordagem confiável para a transformação de protoplastos de Physcomitrella patens.
- Permite a realização de experimentos subsequentes, como RNAi transitório e inativação gênica.
- O protocolo pode auxiliar significativamente na compreensão da função gênica em musgos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A transformação mediada por PEG de protoplastos de Physcomitrella patens permite a entrega eficiente e reprodutível de genes, apoiando a genômica funcional de alto rendimento em sistemas vegetais. Essa capacidade é fundamental para equipes de descoberta inicial que buscam investigar a função gênica, validar alvos e acelerar a elucidação de vias metabólicas em um modelo geneticamente manipulável. O potencial de escalonamento e padronização do método torna-o valioso para triagens genéticas abrangentes e desmistificação mecanicista em portfólios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite interrogar rapidamente a função gênica por meio da entrega eficiente de DNA em células de musgo.
- Permite o direcionamento gênico de alta frequência para validação funcional de alvos e análise de vias.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao permitir modificações genéticas precisas em um sistema modelo.
- Aprimora a confiança preditiva para hipóteses biológicas subsequentes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece um protocolo padronizado para gerar grandes quantidades de transformantes para ensaios de triagem.
- Oferece eficiência de transformação reprodutível, apoiando a confiabilidade e escalabilidade do ensaio.
- Permite a preparação de sistemas biológicos validados para avaliação de compostos e triagem fenotípica.
- Reduz a dependência de equipamentos especializados, aumentando o acesso para equipes de desenvolvimento de ensaios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Permite aplicações posteriores, como estudos de RNAi transitório e eliminação gênica relevantes para modelagem de doenças.
- Apóia a continuidade desde a descoberta gênica até a validação pré-clínica em sistemas baseados em plantas.
- Oferece uma plataforma para a exploração translacional de biomarcadores quando alinhada a vias relevantes para doenças.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de transformação insere-se na transição entre a descoberta inicial e a identificação de compostos líderes, permitindo a manipulação genética, a validação de alvos e o desenvolvimento de ensaios em modelos vegetais.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses e a elucidação de vias por meio da entrega eficiente de genes e análise de expressão.
- Triagem: Apoia a preparação e reprodutibilidade de ensaios ao gerar populações de transformantes consistentes.
- Análises: Fornece resultados quantitativos, como eficiência de transformação e expressão proteica, para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Permite estudos genéticos que orientam o desenvolvimento de modelos pré-clínicos e a identificação de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma capacidade de transformação padronizada e amplamente aplicável para diversos estudos genéticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de função gênica.
- Valor Operacional: Oferece padronização, reprodutibilidade e escalabilidade para fluxos de trabalho de transformação genética.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção e a eficiência do capital ao permitir a geração robusta de dados em estágios iniciais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de alvos e vias genéticas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células vegetais e técnica estéril para o isolamento e transformação de protoplastos.
- Necessita de acesso à infraestrutura básica de laboratório, incluindo centrifugação e microscopia de fluorescência para validação dos resultados.
- Exige padronização entre equipes dos parâmetros de transformação para reprodutibilidade entre projetos.
- Pode exigir adaptação para uso em outras espécies vegetais ou sistemas modelo além de Physcomitrella patens.
- A eficiência de transformação é sensível à concentração de DNA, sendo que quantidades maiores podem ser prejudiciais.
