Ion Beam centrada Fresagem e Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido Cerebral

O objetivo deste procedimento é coletar imagens em série por meio de uma região específica do tecido cerebral utilizando o microscópio de íons focalizados e microscopia eletrônica de varredura. Isso é realizado primeiramente seccionando o cérebro em fatias que são coradas e posteriormente emblocadas em resina. O segundo passo consiste em cortar a região de interesse do segmento cerebral emblocado e montá-la sobre um bloco de resina virgem.

O terceiro passo é aparar o bloco de resina com um ultramicrótomo e usar o feixe de íons do microscópio para isolar somente a região a ser imageada. O passo final consiste em obter imagens em série de uma face do bloco de resina, utilizando o feixe de íons para remover repetidamente camadas finas antes de cada aquisição de imagem. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram imagens em série através de uma região de interesse.

A série de imagens é coletada automaticamente e o conjunto de dados geralmente possui vóxeis isotrópicos, de modo que as estruturas da imagem possam ser visualizadas de qualquer ângulo na pilha. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a microscopia eletrônica de transmissão em seções seriadas, é a capacidade de alcançar uma resolução Z muito maior. Em comparação com a tomografia eletrônica, é capaz de imagens de volumes muito maiores em uma resolução ideal para amostras embutidas em resina.

O procedimento começa com a dissecação do cérebro fixado de uma rata anestesiada e perfundida. Incorpore o cérebro em aerossol a 5% aquecido em um molde plástico, oriente o cérebro para o ângulo correto antes que o aerossol solidifique e monte o bloco de aerossol com o cérebro em um suporte de amostra usando um vibrátomo. Corte secções coronais de 80 mícrons, obtendo tantas secções quanto forem necessárias para incluir a região de interesse.

Em seguida, coloque as amostras em frascos de vidro com isolamento de 20 mililitros. Coloque até 10 seções por frasco. Lave as amostras três vezes, por cinco minutos cada, em tampão K coate 0,1 molar.

Em seguida, corar as amostras com cianeto de potássio a 1,5% e tetróxido de ósmio a 1% em tampão K coate 0,1 molar por 30 minutos. Continuar a coloração das amostras com tetróxido de ósmio a 1% em tampão K coate 0,1 molar por 30 minutos. Após isso, lavar uma vez com água destilada duplamente por três minutos, em seguida corar com acetato de alumínio a 1% em água destilada duplamente por 30 minutos.

Em seguida, lave as seções por cinco minutos em água destilada duplamente, e então desidrate-as em uma série de álcool em gradiente, permitindo dois minutos para cada mudança. O próximo passo é embutir as seções em concentrações crescentes de resina Duran misturada com álcool, permitindo 30 minutos entre cada mudança. Inicie com 50 de etanol para 50 de resina, depois 30 para 70, depois 10 para 90, finalmente colocando as seções em resina a 100% por 30 minutos.

Em seguida, substitua o meio por resina duran fresca a 100%. Agite lentamente por uma hora no misturador rotativo. Após a inclusão, use um palito de madeira para posicionar as seções em lâminas de microscopia de vidro previamente revestidas com agentes separadores de molde.

Coloque o maior número possível de seções nos lâminas, mas tome cuidado para não sobrecarregar as lâminas. Certifique-se de que uma etiqueta de identificação também seja colocada entre as lâminas do microscópio. Coloque as lâminas em uma estufa a 65 graus Celsius por 24 horas.

No dia seguinte, retire as amostras do forno. Empurre suavemente uma lâmina de barbear entre as lâminas de vidro do microscópio e remova a camada de resina contendo as amostras de entre as lâminas, segurando a camada de resina com os dedos. Lave suavemente a amostra sob água corrente.

Para remover quaisquer agentes de separação de molde, coloque a amostra sob um microscópio estereoscópico com iluminação transmitida, utilizando uma objetiva de baixo aumento. Marque a região de interesse com uma agulha fina. Use uma lâmina de barbear para cortar um pequeno quadrado de três milímetros por três milímetros ao redor da região de interesse.

Use cola acrílica para fixar o bloco pequeno de resina na parte superior de um bloco de resina em branco. Em seguida, prenda o bloco no suporte do ultramicrótomo. Olhando através do microscópio estereoscópico acoplado, use uma lâmina de barbear para aparar ao redor da região de interesse até que reste apenas uma pequena pirâmide de material.

Corte a borda do bloco próximo à região de interesse em um ângulo em relação à superfície superior do bloco usando uma lâmina de vidro fixada ao ultramicrótomo. Apare ainda mais o bloco para que a região de interesse possa ser localizada com precisão em relação às dimensões da superfície do bloco. Remova o bloco do ultramicrótomo e coloque-o sob um microscópio de luz transmitida.

Fotografe a região de interesse. Use uma serra de ourives para cortar o bloco aparado longe do restante do toco de resina com tinta de carbono. Fixe o bloco SA no suporte de amostra de MEV e oriente-o de modo que o lado a ser imageado fique voltado para a borda mais externa.

Após a cola ter secado, transfira o preparo para um sistema de evaporação sob vácuo em crescente e recubra o bloco com uma fina camada de ouro com espessura superior a 20 nanômetros. O bloco de tecido embutido em resina está agora pronto para ser analisado no microscópio eletrônico de varredura com feixe de íons focalizado. Insira a amostra, em seu suporte, no microscópio com baixa ampliação e, utilizando a imagem de elétrons secundários, oriente o bloco de modo que a região de interesse e a face do bloco a ser analisada estejam voltadas para frente.

O operador orienta o bloco de modo que a face a ser imageada fique paralela ao feixe de usinagem. Isso faz com que o feixe de elétrons seja orientado a 54 graus em relação a essa face, utilizando uma corrente de feixe iônico de 13 a 27 nanoampères a 30 quilovolts.

Remova uma faixa estreita de resina da frente da região a ser imageada. Em seguida, mude para o modo de imagem de elétrons retroespalhados para visualizar a face usinada que recobre a região de interesse. Usando a imagem de referência de microscopia óptica obtida anteriormente e a imagem da face usinada, localize a região exata no bloco a ser usinada e imageada utilizando o sistema de injeção de gás do microscópio.

Deposite uma camada protetora de carbono ou metal com cerca de um mícron de espessura sobre a superfície do bloco acima da região de interesse, utilizando uma corrente de 700 picoampères. Por fim, usine a região do bloco onde serão obtidas as imagens finais. Permite-se que o feixe de usinagem remova completamente essa face de imagem até que não sejam visíveis artefatos de usinagem na superfície.

Selecione os parâmetros do microscópio para a aquisição de imagens em série da face. Os parâmetros típicos são tensões entre 1,2 e dois quilovolts, com tamanhos de pixel entre quatro e 20 nanômetros. O tempo de permanência do pixel deve ser de aproximadamente 10 microssegundos, de modo que o tempo total para usinar a face e adquirir uma imagem seja inferior a dois minutos.

Deixe o microscópio em repouso por pelo menos duas horas para que quaisquer alterações térmicas se estabilizem. Para dissipar, inicie o processo de moagem e imageamento para adquirir imagens em série através da região de interesse. Esta figura mostra a imagem reversa de elétrons retroespalhados da face do bloco, revelando a ultraestrutura dentro de uma região do cérebro envolto.

Todas as membranas são visíveis, bem como estruturas macromoleculares grandes. Esta figura é composta por um total de 1.600 imagens coletadas com espaçamento de cinco nanômetros, resultando em uma pilha de imagens com vóxeis isotrópicos. Essa pilha pode ser visualizada em qualquer plano com a mesma resolução.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar tecido cerebral para imageamento em série com o microscópio eletrônico de varredura com feixe focado.