Detecção de modificações pós-translacionais sobre Native Nucleossomos Intact por ELISA

O objetivo geral deste procedimento é determinar com precisão os níveis relativos de modificações pós-traducionais em preparações de nucleossomos celulares totais obtidos a partir de um milhão de células. Isso é realizado primeiramente preparando culturas homogêneas de alta qualidade de células de mamíferos. Em seguida, os núcleos são isolados das células por meio de disruptura mecânica com um homogeneizador Dounce e centrifugação.

O próximo passo é obter nucleossomos intactos digerindo a cromatina presente dentro dos núcleos e realizando uma série de extrações hipotônicas. Por fim, os nucleossomos são analisados utilizando um ensaio ELIZA com os controles apropriados para identificar modificações pós-traducionais específicas. Em última instância, podem-se obter resultados que mostram os níveis relativos de modificações específicas presentes nas amostras de nucleossomos.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o western blot e a imunoprecipitação de cromatina, é que uma visão global de diversos estados de modificação de nucleossomos pode ser facilmente determinada. O método é muito mais sensível e preciso do que o western blot e pode ser realizado na maioria dos laboratórios equipados para experimentação geral em biologia molecular. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de células-tronco e epigenética, como o que ocorre durante eventos importantes de diferenciação e reprogramação.

Para iniciar o procedimento, primeiro tripsinize as células com três mililitros de tripsina por placa de 15 centímetros para obter células recém-tripsinizadas. Adicione 20 mililitros de PBS butirato gelado. Transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue o tubo para recolher as células a 1000 RPM durante cinco minutos, aspire o sobrenadante e adicione 10 mililitros de PBS butirato gelado para lavar; centrifugue novamente a suspensão celular a 1000 RPM durante cinco minutos.

Remova o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular em quatro mililitros de tampão de lise com inibidores de protease conforme descrito no protocolo escrito. Em seguida, pipete as células para um homogeneizador com pistilo tipo B e homogeneíze com 20 movimentos sobre gelo. Depois, transfira o homogeneizado para um tubo de centrífuga sobre gelo.

Centrifugue a amostra a 2000 ×g por 10 minutos. A quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante, que contém o material citoplasmático e as resus.

Suspenda o pellet em dois mililitros de tampão de lavagem frio C com inibidores de protease, sobrepondo suavemente o material ressuspenso em um coxim de cinco mililitros de sacarose a 30% em um tubo de centrífuga frio. Para isolar os núcleos, centrifugue a 2.400 ×g durante cinco minutos em um rotor com rotor de balde oscilante; os núcleos migrarão através do coxim e os detritos celulares permanecerão na interface. Após a centrifugação, remova cuidadosamente todo o volume líquido e ressuspenda os núcleos em 250 microlitros de tampão de lavagem frio C com inibidores de protease, transferindo os núcleos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Para iniciar o isolamento de nucleossomos, adicione três microlitros de cloreto de cálcio 0,1 molar aos núcleos e coloque-os em um bloco térmico a 37 graus Celsius até que a temperatura esteja equilibrada. Em seguida, adicione duas unidades de nucleases microcócica em 10 microlitros de tampão de nucleases microcócica e incube por 12 minutos a 37 graus Celsius. Misture frequentemente com a ponteira de uma pipeta.

Após a incubação, interrompa a reação com seis microlitros de E-D-T-A de sódio 0,5 molar, pH 8, e coloque no gelo para resfriar. Em seguida, centrifugue a amostra a 2000 ×g por quatro minutos; após a centrifugação, descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 300 microlitros de EDTA de sódio 0,2 milimolar. Incube a amostra no gelo por uma hora, com pipetagem suave ocasional para misturar.

Após uma centrifugação a 3000 ×g por quatro minutos, a quatro graus Celsius, colete o sobrenadante, que contém os nucleossomos livres, em um novo tubo Fuge e mantenha em gelo para um reuso deliberado de nucleossomos adicionais. Suspenda o precipitado em 300 microlitros de 0,2 milimol por litro de EDTA de sódio, como anteriormente, e incube em gelo por uma hora com mistura suave ocasional.

Após a incubação, centrifugue a amostra. Novamente, combine o sobrenadante resultante com a amostra restante no tubo de microcentrífuga em gelo. Para iniciar o ensaio de nucleossomos por ELISA, carregue uma placa de ELISA de 96 poços com uma série descendente de cinco diluições seriadas em duplicata de nucleossomos e tampão de revestimento, começando com 0,1 micrograma por 50 microlitros no poço superior; todas as séries de diluição devem ser carregadas em triplicata.

Lembre-se de incluir poços apenas com tampão de revestimento como controles. Incube a placa durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Use uma lavadora de placas para lavar as placas com 200 microlitros por poço de 0,5% entre 20 em PBS à temperatura ambiente, quatro vezes, por um tempo total combinado de 10 minutos.

Agora, adicione 100 microlitros por poço da solução bloqueadora e incube por uma hora à temperatura ambiente em um agitador rotativo. Após a incubação, remova o tampão bloqueador agitando vigorosamente a placa invertida sobre uma pia. Em seguida, adicione o anticorpo primário diluído em um volume de 50 microlitros por poço em uma solução de 5% PSA em 0,05% entre 20 em PBS e incube a solução por uma hora em agitador rotativo à temperatura ambiente.

Após a incubação com o anticorpo primário, lave as placas como anteriormente utilizando o lavador de placas. Uma vez concluído o procedimento de lavagem, adicione 50 microlitros por poço do anticorpo secundário conjugado à peroxidase de rábano-forrageiro diluído em PBS com 5% de BSA e 0,5% de Tween 20, e incube à temperatura ambiente por uma hora em agitador rotativo após a incubação com o anticorpo secundário. Lave as placas como anteriormente.

Utilizando o lavador de placas para desenvolver a placa. Adicione 50 microlitros de substrato TMB Eliza a cada poço e incube por 10 minutos. À temperatura ambiente, os poços da placa ELIZA ficarão azuis e a intensidade é proporcional à quantidade de modificações de nucleossomos presentes em cada um.

Bem, então pare a reação. Adicione 50 microlitros por poço de ácido sulfúrico 2 normal. A cor mudará para marrom; centrifugue a placa a 1500 RPM por dois minutos para dissipar quaisquer bolhas de ar.

A placa está agora pronta para quantificação em um leitor de placas colorimétrico. Por fim, leia a placa a 450 nanômetros e exporte os resultados para análise. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em dois dias, se for executada corretamente após o seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu portas para pesquisadores na área de pesquisa com células-tronco explorarem respostas epigenéticas a eventos de diferenciação e reprogramação no nível de todo o epiproteoma.