Medindo Coordenação Motora em Ratos
29 de maio de 2013
Protocolos são apresentados para duas tarefas estabelecidas coordenação motora, o bar rotarod e horizontal, acelerando também dois testes desenvolvidos em Oxford recentemente, as hastes estáticos e barras paralelas. Estes testes podem detectar deficiências motoras potencialmente de interesse em seu próprio direito, bem como possíveis variáveis em testes de outras áreas do comportamento.
O objetivo geral deste procedimento é medir a coordenação motora em camundongos. Isso é realizado primeiramente com o teste na barra rotatória com aceleração. Em seguida, a coordenação motora é testada na barra horizontal.
O animal também pode ser testado em barras estáticas. Por fim, o desempenho nas barras paralelas pode ser medido. Em última análise, podem ser obtidos resultados que indicam se o camundongo apresenta algum comprometimento na coordenação motora.
Em geral, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldades devido à complexidade de posicionar corretamente o camundongo no aparelho para todos os testes a seguir. Leve os camundongos à sala experimental de cinco a vinte minutos antes do teste para garantir que estejam completamente acordados. A cena do bastão rotatório aqui apresentada foi construída na Universidade de Oxford.
A haste tem três centímetros de diâmetro com uma série de saliências paralelas em sua superfície, que ajudam os camundongos a segurá-la de forma mais eficaz. Uma flange em cada lado impede que o camundongo saia da haste. Elas têm 30 centímetros de diâmetro e estão separadas por seis centímetros.
A haste é fixada a 30 centímetros da base do aparelho. Uma superfície macia e acolchoada é colocada na base para amortecer quedas antes do início do ensaio. Prepare o rotor haste ajustando uma velocidade inicial de quatro rotações por minuto e uma taxa de aceleração de 20 rotações por minuto.
Para começar, segure o camundongo pela cauda e levante-o em direção à barra em um ângulo de 45 graus abaixo da horizontal. Solte rapidamente o animal quando estiver quase tocando a barra. Alternativamente, o camundongo pode ser abaixado sobre uma haste, e a haste será usada para transferir o animal até a barra.
Inicie a aceleração 10 segundos após colocar o camundongo na haste e anote a velocidade na qual o camundongo cai. Se o camundongo cair antes de cinco segundos e isso provavelmente for devido à má colocação pelo experimentador, o resultado não deve ser registrado e o ensaio deve ser reiniciado se a queda ocorrer antes de 10 segundos. Anote o tempo e permita que o animal tenha mais duas tentativas.
Para os animais que permanecem além de 10 segundos, registre a velocidade com que o animal cai. Ocorre às vezes que o camundongo pare de andar e, consequentemente, dê algumas voltas em torno da haste antes de cair eventualmente. É útil anotar a velocidade com que esse evento ocorre.
O desempenho é calculado como a velocidade média entre as tentativas. Por exemplo, um camundongo que cai antes de 10 segundos uma vez e depois permanece até 12 rotações por minuto. A segunda vez resulta em quatro mais 12 dividido por dois, igual a oito rotações por minuto.
A barra horizontal mede a força e a coordenação dos membros posteriores, sendo uma barra com diâmetro de dois milímetros a mais comumente utilizada. Barras de diâmetro maior podem fornecer escores de desempenho mais refinados. Barras de latão com 38 centímetros de comprimento são mantidas a 49 centímetros acima da superfície da bancada por uma coluna de suporte de madeira.
As barras são mantidas sob tensão ao serem encaixadas nas ranhuras dos suportes, que são ligeiramente aproximados. Inicie o teste com a barra de dois milímetros. Segure o camundongo pela cauda e coloque-o sobre a bancada, na frente do aparelho.
Deslize-o rapidamente. Cerca de 20 centímetros para trás, para alinhar rapidamente o corpo perpendicularmente à barra. Levante o animal, permitindo que ele segure a barra horizontal no centro apenas com suas quatro patas.
Solte a cauda enquanto simultaneamente inicia um cronômetro. Se o camundongo não conseguir segurar a barra e a colocação feita pelo experimentador for a causa, não registre a queda e reteste o animal após um breve descanso.
Se o camundongo cair antes de cinco segundos, e isso aparentemente não for devido à má colocação pelo experimentador, repita até três vezes na tentativa de obter uma pontuação superior a cinco segundos. Registre o tempo em que o camundongo cai ou o tempo até um dos quatro membros tocar em uma coluna, com um tempo máximo de teste de 30 segundos, adotando a melhor pontuação como dado para pontuar a barra horizontal. Se o animal cair entre um e cinco segundos, atribua uma pontuação de um; entre seis segundos e 10 segundos, atribua a pontuação correspondente.
Marque dois entre 11 segundos e 20 segundos. Marque três entre 21 segundos e 30 segundos. Marque quatro se cair após 30 segundos ou permanecer na barra até 30 segundos.
Obtém cinco pontos, e o camundongo também obtém cinco pontos se tocar em uma extremidade. Apoie com suas quatro patas a qualquer momento durante o teste. Se uma pontuação de cinco for alcançada na barra de dois milímetros, o animal pode então ser testado em barras mais grossas após um breve descanso.
O sistema de pontuação para as barras de quatro e seis milímetros é o mesmo utilizado para a barra de dois milímetros, e a pontuação final é o total acumulado. Assim, um camundongo que obtém cinco pontos na barra de dois milímetros, mas cai da barra de quatro milímetros após 13 segundos, terá uma pontuação de cinco mais três, totalizando oito.
Neste teste de coordenação motora, hastes ou bastões de madeira de espessuras variadas — 35, 28, 22, 15 e nove milímetros de diâmetro, cada um com 60 centímetros de comprimento — são fixados por um grampo em forma de G a uma prateleira de laboratório situada a 60 centímetros do chão. Uma marca é feita a 10 centímetros da extremidade próxima à bancada para indicar a linha de chegada. Para iniciar, coloque o camundongo na extremidade oposta da haste mais larga, voltado para longe da prateleira, e registre o tempo necessário para o animal se orientar em direção à prateleira e o tempo total de percurso.
Se o camundongo virar de cabeça para baixo e se agarrar abaixo da barra durante a orientação, atribua-lhe arbitrariamente a pontuação máxima de 120 segundos. O animal não é testado nas outras barras e recebe também um valor máximo de trânsito. Se o camundongo cair ou atingir o tempo máximo de teste de 120 segundos após a orientação, não o teste em barras mais estreitas.
Uma pontuação máxima também é atribuída se o camundongo girar de cabeça para baixo ao atravessar o bastão após a orientação; nesse caso, retorne o camundongo à gaiola de origem e permita que descanse antes do teste. O próximo bastão menor. Coloque o animal sobre o bastão menor conforme mostrado anteriormente.
Se o camundongo cair antes de cinco segundos, recoloque-o e permita até duas tentativas adicionais. Registre o tempo necessário para inverter a barra ou até o camundongo cair. Para montar as barras paralelas, apoie duas barras, com um metro de comprimento e quatro milímetros de diâmetro, separadas por 30 milímetros, sobre um suporte de madeira.
Colunas a 60 centímetros acima do piso. Coloque o camundongo no centro das duas barras, com seu eixo longitudinal perpendicular às barras. Ambas as patas dianteiras devem estar em uma barra, com ambas as patas traseiras na outra barra.
A pontuação é semelhante à dos bastões estáticos. São registradas duas medidas: o tempo até o camundongo se orientar a 90 graus em relação à posição inicial e o tempo até alcançar um dos suportes finais. Da mesma forma, a orientação e o trânsito devem ser realizados sem que o animal fique de cabeça para baixo; caso contrário, é atribuído o tempo máximo.
Se o animal cair antes de cinco segundos, isso provavelmente se deve a uma má colocação e o animal deve ser retestado. Uma barra estática foi originalmente usada para monitorar a progressão da doença em camundongos mutantes com ou sem enriquecimento ambiental em suas gaiolas de origem. O programa de enriquecimento atrasou drasticamente o início da disfunção motora na barra, o que foi acompanhado por um atraso no início do aperto inadequado das patas traseiras.
Um sinal geral de comprometimento neurológico em camundongos infectados foi a diminuição do desempenho na barra horizontal a partir da semana 16 após a injeção, nos testes de barra rotatória a partir da semana 18 e nas barras estáticas a partir de pelo menos a semana 19. As lesões no hipocampo não tiveram efeito em nenhuma medida de habilidade motora, mas camundongos SV 1 2 9 s apresentaram prejuízo em relação à linhagem C 57 black six na barra rotatória e nas barras estáticas após o desenvolvimento da doença. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores da doença de Huntington estudarem os efeitos do enriquecimento ambiental em camundongos mutantes para a doença de Huntington.
Visão Geral
Este artigo apresenta protocolos para avaliar a coordenação motora em camundongos utilizando diversas tarefas, incluindo os testes de rotarod acelerado e de barra horizontal. Além disso, introduz dois testes recentemente desenvolvidos, barras estáticas e barras paralelas, que podem identificar déficits motores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Análise Comportamental
- Coordenação Motora
Antecedentes
- A coordenação motora é fundamental para compreender diversas condições neurológicas.
- Testes estabelecidos, como o rotarod, têm sido amplamente utilizados na pesquisa.
- Novos testes desenvolvidos em Oxford visam aprimorar a detecção de comprometimentos motores.
- Esses testes também podem servir como variáveis em estudos comportamentais mais amplos.
Objetivo do Estudo
- Medir a coordenação motora em camundongos utilizando protocolos estabelecidos e novos.
- Identificar possíveis déficits motores em sujeitos experimentais.
- Fornecer uma abordagem padronizada para pesquisadores da área.
Métodos Utilizados
- Teste de rotarod acelerado para avaliar preensão e equilíbrio.
- Teste da barra horizontal para força e coordenação dos membros.
- Teste de barras estáticas para avaliar orientação e equilíbrio.
- Teste de barras paralelas para medir a coordenação motora geral.
Resultados Principais
- Os resultados indicam níveis variados de coordenação motora entre os camundongos testados.
- As métricas de desempenho fornecem informações sobre possíveis comprometimentos.
- Novos testes mostram potencial na detecção de déficits motores sutis.
- Protocolos padronizados facilitam a reprodutibilidade na pesquisa.
Conclusões
- O estudo descreve com sucesso métodos para avaliar a coordenação motora.
- Tanto os testes estabelecidos quanto os novos são eficazes na identificação de comprometimentos motores.
- Pesquisas futuras podem se basear nestes protocolos para explorar condições neurológicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação da coordenação motora em camundongos é fundamental para reduzir riscos na validação de alvos em descoberta de fármacos em neurociência, assegurando que os fenótipos comportamentais observados reflitam mudanças cognitivas ou emocionais reais e não déficits motores confundidores. Testes motores padronizados permitem confiança preditiva no estágio inicial de descoberta ao isolar a função motora como uma variável independente, apoiando decisões de avançar ou interromper nos fluxos de validação de alvos. Esses ensaios proporcionam continuidade translacional do engajamento do alvo à triagem fenotípica, reduzindo a desistência em estágios avançados devido a efeitos colaterais motores inesperados.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas dissociando déficits motores de fenótipos cognitivos ou emocionais em modelos mutantes ou com lesões.
- Valor Operacional: Permite a dissecção seletiva de interferências motoras em ensaios comportamentais como o labirinto aquático de Morris, melhorando a interpretabilidade dos dados.
- Valor Estratégico: Apoia a redução de riscos do alvo ao validar que os fenótipos observados não são secundários a disfunção motora, aumentando a confiança na associação entre alvo e mecanismo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, confirmando a competência motora basal antes de testes cognitivos.
- Valor Operacional: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis (por exemplo, velocidade de queda no rotarod, tempo de preensão na barra horizontal), permitindo a padronização de ensaios entre diferentes locais.
- Valor Estratégico: Facilita a avaliação escalável de compostos ao garantir que o desempenho motor não interfira nos resultados de resposta à dose ou em triagens.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao detectar déficits motores em modelos da doença de Huntington e outras condições neurodegenerativas.
- Valor Operacional: Oferece continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo o acompanhamento longitudinal da deterioração motora.
- Valor Estratégico: Apoia decisões de avanço com base no risco ao identificar precocemente sinais de segurança motora ao longo do processo de descobrimento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e o triagem pré-clínica, em que a coordenação motora atua como um filtro crítico de confundidores antes da avaliação de desfechos cognitivos ou emocionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao isolar a função motora como uma variável independente, esclarecendo se os fenótipos observados decorrem do engajamento do alvo ou de toxicidade motora.
- Triagem: Garante a prontidão do ensaio ao validar a competência motora, reduzindo falsos negativos em triagens comportamentais devido ao desempenho motor deficiente.
- Análises: Gera medidas quantitativas (velocidade de queda no rotarod, duração do aperto na barra) que permitem comparação objetiva entre genótipos, tratamentos ou pontos temporais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar a deterioração motora progressiva em modelos de doenças neurodegenerativas, apoiando o alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade de plataforma reutilizável em diversos projetos de neurociência, padronizando a avaliação motora entre classes de alvos e modalidades.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista em fenótipos comportamentais, garantindo que os efeitos observados sejam específicos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos definidos, parâmetros de aceleração e sistemas de pontuação em diferentes modalidades de teste.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir decisões mais precoces de prosseguir ou interromper, reduzindo investimentos em alvos com fenótipos confundidos por alterações motoras.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco ao identificar comprometimentos motores que poderiam prejudicar a translação clínica.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em neurociência comportamental e manejo de roedores para garantir o posicionamento adequado e minimizar artefatos induzidos pelo posicionamento.
- Depende de instrumentação calibrada (por exemplo, rotarod acelerado com controle preciso de velocidade, aparelho de barra horizontal com regulação de tensão).
- Necessita padronização entre equipes quanto aos períodos de aclimatação (5–20 minutos), regras de repetição de ensaios e critérios de pontuação para assegurar a comparabilidade dos dados.
- Envolve considerações de adaptação entre diferentes sistemas modelo, já que diferenças de linhagem (por exemplo, C57BL/6 vs. SV129) e variabilidade baseada no sexo afetam o desempenho motor basal.
- Inclui limitações práticas, como a suscetibilidade ao viés de posicionamento pelo experimentador, especialmente nos ensaios iniciais, exigindo protocolos de reteste e exclusão de valores aberrantes.
