Fabricação de um dispositivo micro para a compartimentação de Neuron Soma e axônios
22 de agosto de 2007
Neste vídeo podemos demonstrar a técnica da litografia macia com polydimethyl siloxano (PDMS) que usamos para farbricate um dispositivo micro para os neurônios cultura.
Bem-vindo ao laboratório do Dr. Newly John. O Laboratório John especializa-se na engenharia de plataformas microfluídicas para aplicações biológicas. Neste vídeo, demonstraremos a produção e utilização de um dispositivo microfluídico projetado para compartimentalizar e cultivar neurônios primários.
O dispositivo neuronal foi publicado pela primeira vez na Nature Methods em agosto de 2005. Desde sua introdução, o dispositivo neuronal tem sido amplamente utilizado por colaboradores em todo o mundo. O dispositivo neuronal consiste em um pedaço de PDMS que foi moldado sobre uma pastilha de silício contendo um padrão de SUA do dispositivo, previamente criado por fotolitografia.
O dispositivo possui três características principais, quatro reservatórios, oito milímetros de diâmetro, dois canais principais, cada um com 1,5 milímetro de largura, sete milímetros de comprimento e cem mícrons de altura, e microcanais, que têm 10 mícrometros de largura e três mícrometros de altura, conectando os dois canais principais. Os microcanais podem variar em comprimento de 150 mícrons a 900 mícrons, embora o comprimento padrão escolhido seja de 450 mícrons. Observando o dispositivo de modo que os canais principais e os microcanais estejam na vertical, podemos ver que os reservatórios à esquerda dos canais estão conectados por meio dos canais principais, assim como os reservatórios à direita.
Este recurso permite que o líquido flua através do canal principal, uma característica importante que torna possível o carregamento de células e a troca de meio. O dispositivo neuronal apresenta três grandes vantagens em comparação com as plataformas tradicionais de cultura de tecidos. Primeiro, permite a compartimentalização separada dos corpos celulares ou somas e dos axônios. Com o dispositivo neuronal, é possível obter frações axonais puras.
O tamanho e o comprimento das micro-ranhuras permitem que os axônios atravessem o outro canal principal, ao mesmo tempo que impedem os corpos celulares de atravessar. Em segundo lugar, devido ao design do dispositivo e aproveitando a pressão hidrostática, é possível submeter o lado celular e/ou o lado axonal do dispositivo a tratamentos separados, bastando manter o volume e os reservatórios mais altos em um lado do dispositivo em comparação ao outro. E em terceiro lugar, a fração pura de axônios do dispositivo pode ser coletada por sucção a vácuo, permitindo ao pesquisador estudar e observar a regeneração axonal.
A pesquisadora Hina Lee demonstrará agora o preparo do dispositivo microfluídico de neurônios. Um substrato de silício de três polegadas com um padrão feito de SU-8 por fotolitografia é usado para moldar o molde microfluídico de PDMS (poli-dimetil-siloxano). Referimo-nos ao substrato de silício com padrão de SU-8 como moldes-mestre ou simplesmente mestres.
O PDMS é misturado com agente de cura numa proporção de peso para peso de 10 para 1. Ou seja, por exemplo, 15 gramas de PDMS para 1,5 gramas de agente de cura. O PDMS é então bem misturado e despejado sobre a lâmina de silício.
O wafer de silício está contido em uma placa de Petri de poliestireno de 10 centímetros. São necessários aproximadamente 12 gramas a 15 gramas de PDMS para cobrir as MAs com uma espessura de cerca de quatro milímetros. O molde com o PDMS é então colocado em um dessecador a vácuo com a tampa da placa de Petri removida e aplica-se vácuo.
Isso é feito para ajudar a remover bolhas de ar do PDMS que foram introduzidas durante a agitação do agente de cura. Leva aproximadamente 15 minutos para que as bolhas de ar sejam removidas. O molde com PDMS é removido do dessecador após 15 minutos no dessecador a vácuo.
Ainda existem algumas bolhas remanescentes no molde de PDMS. Uma pistola de ar com filtro de 0,45 mícron é utilizada para remover quaisquer bolhas residuais. Em seguida, o molde é colocado em uma placa aquecida a 80 graus por uma hora para cura.
Se um dessecador a vácuo não estiver disponível, o molde pode ser deixado em temperatura ambiente por várias horas. As bolhas de ar eventualmente desaparecerão por si só. Se não houver placa aquecedora disponível, a PDMS curará em temperatura ambiente após 24 horas.
É importante garantir que o molde esteja nivelado durante o processo de cura. Uma vez que a PDMS esteja curada sobre o molde, ela é levada para uma cabine limpa usando uma lâmina cirúrgica. É feito um corte circular ao redor do perímetro dos dispositivos.
É importante que, ao inserir a lâmina no PDMS para fazer contato com a lâmina de silício, não se aplique muita pressão sobre a lâmina, pois, caso contrário, o molde se romperá com um corte circular ao redor dos dispositivos. Há quatro dispositivos por cada molde de silício de três polegadas. O PDMS é cuidadosamente removido do molde.
Isso pode ser iniciado girando suavemente a lâmina cirúrgica enquanto ela é inserida no corte anterior. É muito fino com os dispositivos de PDMS no molde. Os reservatórios com face voltada para cima são perfurados no dispositivo usando um punch de biópsia de tecido de oito milímetros.
O resíduo deixado no furador é empurrado para fora com uma haste. Os dispositivos são então divididos em quartos e o excesso de PDMS é aparado, de modo que o dispositivo se encaixe perfeitamente em uma lamínula Corning. Um vidro número um de 24 milímetros por 40 milímetros é usado com jato de ar de nitrogênio para remover qualquer resíduo em excesso.
Detritos teimosos também podem ser removidos utilizando fita de vinil 3M Scotch Brand 4 7 1. Os dispositivos limpos estão agora prontos para ligação por plasma. Um limpador de plasma Herrick é usado para ligar brevemente os dispositivos neuronais às lamínulas.
Os dispositivos e as lamínulas são colocados em uma bandeja, e a bandeja será então colocada no limpador de plasma e uma bomba de vácuo será usada para evacuar o ar da câmara. É importante observar que os dispositivos de PDMS são colocados com a face voltada para cima. Ou seja, com o desenho voltado para cima, para que fiquem expostos ao gás de plasma.
Após a pressão de vácuo atingir 300 millitorr, a energia é ligada na bobina elétrica e ajustada para o máximo. Abre-se ligeiramente a porta para permitir a entrada de um pouco de ar na câmara, o que ajudará a gerar o plasma. Os dispositivos e o vidro de cobertura são tratados com plasma por dois minutos.
Observe a cor roxa na câmara. Isso é o plasma real. A bobina elétrica cria plasma, que é um gás parcialmente ionizado composto por elétrons, íons e átomos ou moléculas neutros.
O plasma cria espécies reativas na superfície do vidro e do dispositivo, que, quando colocados juntos, formarão uma ligação permanente. O plasma também torna a superfície hidrofílica, o que ajuda a facilitar a adição de líquidos. O limpador de plasma também esteriliza os dispositivos.
Após o tratamento com plasma por dois minutos, a potência no vácuo é desligada e o ar é conduzido para dentro da câmara. As superfícies tratadas com plasma do vidro e do dispositivo microfluídico são montadas em contato uma com a outra em uma bancada limpa. Os dispositivos são então colocados em placas estéreis de 60 milímetros.
As superfícies do vidro e do dispositivo tratadas com plasma formam uma ligação apertada e irreversível. Dentro de 10 minutos após a ligação por plasma, o dispositivo recebe poliol lisina. Após 10 minutos, a hidrofilicidade do dispositivo diminuirá.
Tornando difícil a entrada do PLL no dispositivo. É importante verificar a presença de bolhas de ar no dispositivo após a adição do PLL. Um método simples para remover bolhas de ar existentes é usar uma pipeta P200 preenchida com 100 microlitros de líquido.
Neste caso, pipete o PLL colocando a ponteira diretamente na abertura do canal principal, em seguida pressione com força a pipeta P-200. Isso pode precisar ser repetido várias vezes, mas eventualmente a força da pipeta expulsará as bolhas. Os dispositivos contendo PLL são deixados em incubação durante a noite em um incubador padrão de cultura de tecidos a 37 graus com 5% de CO2.
Após 24 horas de incubação com PLL, os dispositivos são lavados duas vezes rapidamente com água desionizada autoclavada. Durante esse processo, o líquido nunca é completamente removido dos canais principais, apenas dos reservatórios. Remover o líquido dos canais principais introduzirá bolhas.
Após duas lavagens rápidas, os dispositivos são preenchidos novamente com água desionizada autoclavada e recolocados no incubador por um mínimo de três horas ou durante a noite. No dia seguinte, após os dispositivos terem sido incubados com água durante a noite ou por um mínimo de três horas, eles são novamente levados para a cabine de segurança biológica e lavados duas vezes com água desionizada. Em seguida, adiciona-se aos dispositivos o meio basal neural contendo os suplementos necessários, B 27 e glutamato, para o cultivo de neurônios primários de rato.
Os dispositivos são então colocados novamente no incubador para uso futuro. Os dispositivos estão agora prontos para receber os neurônios. Neste vídeo, demonstramos a técnica de litografia suave, que utilizamos para fabricar nossos dispositivos neuronais.
Esses dispositivos podem ser usados para cultivar neurônios e outros tipos celulares de interesse. A principal vantagem desses dispositivos é a capacidade de separar e compartimentalizar o cultivo dos corpos celulares dos neurônios em um lado do dispositivo de uma fração pura de axônios no outro lado do dispositivo. No próximo vídeo, mostraremos como preparamos neurônios corticais fetais de E 18 e como carregamos as células no dispositivo.
Então é isso do Laboratório John. Obrigado por assistir.
Visão Geral
Este vídeo demonstra a técnica de litografia macia utilizando polidimetilsiloxano (PDMS) para fabricar um dispositivo microfluídico destinado ao cultivo de neurônios. O dispositivo permite a compartimentalização dos corpos celulares neuronais e axônios, facilitando estudos avançados em neurobiologia.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Microssistemas
- Técnicas de Cultura Celular
Contexto
- O dispositivo neuron foi publicado pela primeira vez na Nature Methods em agosto de 2005.
- Tem sido amplamente adotado por pesquisadores em todo o mundo.
- O dispositivo é feito de PDMS moldado sobre uma pastilha de silício.
- Apresenta reservatórios e canais projetados para o cultivo de neurônios.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a fabricação de um dispositivo microfluídico para cultivo de neurônios.
- Destacar as vantagens do uso deste dispositivo em comparação com plataformas tradicionais de cultivo de tecidos.
- Fornecer uma metodologia detalhada para a preparação do dispositivo para neurônios.
Métodos Utilizados
- Misturar PDMS com um agente de cura em uma proporção específica.
- Utilizar um dessecador a vácuo para remover bolhas de ar do PDMS.
- Curar o PDMS em uma placa aquecedora ou à temperatura ambiente.
- Realizar ligação por plasma dos dispositivos de PDMS a lamínulas para maior funcionalidade.
Resultados Principais
- O dispositivo permite a compartimentalização de corpos celulares e axônios.
- Ele possibilita tratamentos separados para diferentes compartimentos.
- Os pesquisadores podem obter frações axonais puras para estudo.
- O design facilita a observação da regeneração axonal.
Conclusões
- O dispositivo microfluídico de neurônios é uma ferramenta valiosa para a pesquisa em neurociência.
- Oferece vantagens significativas para o estudo do comportamento neuronal e regeneração.
- O processo de fabricação é detalhado e reproduzível para pesquisadores.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Plataformas microfluídicas compartimentalizadas permitem controle espacial preciso de subpopulações neuronais, apoiando a validação de alvos em modelos de doenças neurodegenerativas. Ao isolar compartimentos de soma e axônio, esses sistemas facilitam a desvinculação mecanicista de candidatos terapêuticos por meio de tratamentos e leituras específicos por compartimento. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, reduzindo o ruído biológico e melhorando a especificidade do ensaio em estudos de regeneração axonal e neuroproteção.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao isolar compartimentos axonais e somáticos para manipulação independente.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio de tratamento específico por compartimento e avaliação da integridade axonal.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança em compostos líderes ao reduzir sinais confundidores provenientes dos corpos celulares em ensaios axonais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas neuronais validados para triagem de compostos com leituras compartimentalizadas.
- Valor Operacional: Padroniza o isolamento axonal e as condições de cultivo, melhorando a reprodutibilidade entre campanhas de triagem.
- Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma para múltiplos alvos e modalidades terapêuticas na descoberta em neurociência.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Mantém a arquitetura neuronal relevante para a doença, desde a descoberta até a validação pré-clínica.
- Desvio Mecanístico de Risco: Permite a avaliação do engajamento do alvo e da modulação da via em axônios, sem interferência somática.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões de avançar/não avançar com base em fenótipos de regeneração ou degeneração axonal.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O dispositivo microfluídico de neurônios integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e os testes pré-clínicos de eficácia, permitindo análises específicas por compartimento em cada estágio.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao isolar respostas axonais a perturbações terapêuticas.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios e leituras axonais quantitativas para avaliação confiável de compostos em programas de neurodegeneração.
- Análises: Gera medições específicas por compartimento (por exemplo, crescimento axonal, degeneração) que permitem comparação objetiva de condições de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta inicial à continuidade pré-clínica ao preservar a polaridade neuronal e permitir ensaios axonais alinhados a biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma plataforma reutilizável em múltiplos projetos, reduzindo custos de re-desenvolvimento e garantindo modelos neuronais consistentes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas respostas axonal versus somática.
- Valor Operacional: Garante padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos ensaios de compartimentalização neuronal.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção, a eficiência do capital e reduz o risco biológico em estágios avançados em portfólios de neurodegeneração.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco com base em perfis de eficácia e segurança específicos por compartimento.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em design de microfluídica, manipulação de PDMS e técnicas estéreis de cultivo celular.
- Depende do acesso a limpeza por plasma, dessecadores a vácuo e ferramentas de fabricação de precisão para a preparação do molde mestre.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de fabricação e controle de qualidade para garantir consistência entre dispositivos.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a neurônios derivados de iPSCs humanos ou modelos de doenças com dinâmica de neuritos alterada.
- Inclui limitações práticas, como a contaminação do dispositivo durante cultivos de longo prazo e a necessidade de manutenção do meio para prevenir formação de bolhas nos canais.
