Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Este protocolo demonstra como obter imagens de eventos dinâmicos em embriões de CL egan's no início do desenvolvimento, utilizando óptica DIC Norky ou fluorescência, com microscópios amplamente disponíveis e software de código aberto. O protocolo inicia com a descrição da dissecação de embriões de CL gans e seu acondicionamento para aquisição de imagens. Em seguida, revisa-se a configuração adequada da óptica DIC com máscara Norky para garantir imagens ideais com o máximo de detalhe.

A calibração da fluorescência epiluminescente de campo amplo e da iluminação também é revisada para coletar bons dados de imagem fluorescente combinados com software de código aberto. Uma boa microscopia pode visualizar a dinâmica celular em um embrião em desenvolvimento. Ilustrações visuais deste método são fundamentais, pois configurar corretamente a óptica D iic é difícil, já que a terminologia pode ser confusa e a técnica adequada é difícil de descrever por escrito.

Além disso, os pesquisadores devem ter cuidado para minimizar a exposição à luz durante a realização de imagens fluorescentes. Para limitar a fototoxicidade e o fotodesbotamento, para preparar embriões para imagem, primeiro prepare duas soluções de montagem. Uma é vaselina derretida e a outra é dois a 3% de aros em tampão.

Pode-se preparar aros mais densos se as estruturas a serem visualizadas forem muito frágeis, tomando cuidado para evitar fervura. Ambas as soluções estoque são derretidas no micro-ondas e então armazenadas em alíquotas de quatro a cinco mililitros. No dia da aquisição de imagens, derreta uma alíquota da solução de vaselina em um bloco térmico de 65 a 70 graus Celsius e derreta uma alíquota da solução de aros no micro-ondas.

Novamente, evite ferver. Em seguida, para manter essas soluções no estado fundido, armazene-as em um bloco de aquecimento. Depois, cubra a parte superior e inferior de duas lâminas com uma tira de fita adesiva laboratorial e posicione uma lâmina limpa entre as duas lâminas com fita.

Agora, pingue algumas gotas do aros fundido sobre a lâmina limpa e cubra-a com outra lâmina limpa. O Aros se espalha formando uma fina camada quadrada com o tampão preparado. Use um microscópio estereoscópico e uma alça de fio de platina para transferir dois vermes adultos para uma gota de nove a 12 microlitros de tampão sobre uma lamínula de 18 por 18 milímetros.

Em seguida, corte. Abra os vermes com uma agulha ou bisturi para liberar os embriões com o lado do agarro voltado para baixo. Posicione a almofada de vermes sobre a lamínula de 18 por 18 milímetros e corte com uma lâmina qualquer excesso de agar.

Por fim, para selar a lamínula, aplique a solução de vaselina fundida ao longo de sua periferia com um pincel ou palito de dente. As células estão agora prontas para a aquisição de imagens. Ao colocar a lâmina no microscópio, certifique-se de que os dois polarizadores estejam alinhados perpendicularmente um em relação ao outro.

Certifique-se de que tanto os diafragmas quanto os prismas estejam fora do trajeto da luz. Se o campo não estiver escuro, gire o polarizador abaixo do condensador até que fique escuro. Localize os embriões utilizando a objetiva de 10 vezes.

Procure perto dos corpos dos vermes grupos de embriões jovens para obter múltiplos embriões dentro do campo de imagem. Evite embriões dentro do verme para obter as melhores imagens. Após localizar os melhores embriões, mude para uma objetiva de maior aumento.

Agora, troque o cubo de filtro para DIC. Em seguida, insira o prisma de Walston objetiva superior no trajeto da luz e gire o anel no condensador para selecionar o prisma de Walston inferior que corresponde à objetiva. Com os prismas posicionados, ajuste o controle deslizante abaixo deste revólver para coincidir com a abertura numérica da lente.

Para obter a iluminação de Kohler ideal, foque o condensador até que a borda do diafragma do condensador apareça mais nítida. O ponto mais nítido é quando o limite entre a luz e o preto é mais definido ou está em foco. Para obter o contraste ideal, ajuste a parede de maça e o prisma girando o botão no controle deslizante.

Agora o microscópio está quase pronto para ser utilizado. É hora de controlar parâmetros adicionais de imageamento no computador com o software micromanager e de código aberto. Comece ajustando o ganho da câmera para zero.

Em seguida, mude para salvar arquivos como TIFF de oito bits, não de 16 bits. Os arquivos TIFF podem ser analisados posteriormente por softwares de código aberto, como o Image J. Ajuste, então, o nível de luz para que os pixels mais brilhantes estejam logo abaixo dos níveis de saturação. Se tudo tiver sido feito corretamente, a imagem terá aparência tridimensional, com a luz parecendo incidir em um ângulo.

Agora que a imagem está excelente, selecione os embriões que deseja imaginar e desenhe uma região de interesse. Se o microscópio possuir um motor de foco, utilize-o para coletar múltiplos planos focais em cada momento. Abra a janela de aquisição multidimensional e defina os planos superior e inferior da pilha Z ajustando o botão de foco para encontrar o primeiro e o último plano focal com alguns grânulos de gema em foco.

Defina o tamanho do passo. Isso definirá o número de planos focais coletados. Agora, defina um intervalo de tempo suficientemente longo para adquirir todos os planos focais.

Os pontos de tempo máximos podem ser definidos muito altos, de modo que o software capture imagens até ser interrompido manualmente. Configure o software para exibir apenas a última imagem adquirida, para que o processo possa ser monitorado. Agora, atribua um nome de arquivo às imagens e comece a adquiri-las.

A análise de imagem será brevemente revisada ao final da próxima seção. A construção de um filme GFP é semelhante à criação de quatro DIC D nem Musky, mas utiliza-se um arquivo de configuração que inclui o controle de software do obturador fluorescente. Em vez disso, com os embriões localizados, certifique-se de que o prisma walstone superior não esteja no trajeto da luz e troque o cubo de filtro para F-I-T-C-G-F-P.

Se isso não foi definido automaticamente na inicialização usando o software, certifique-se de que o ganho da câmera esteja definido em 255. Um arquivo de imagem é definido no formato tiff de 16 bits. Agora desligue a fonte de luz transmitida e clique em imagem ao vivo.

Ajuste a intensidade da fonte de luz UV e o tempo de exposição para obter uma boa relação sinal-ruído para o sinal de fluorescência; no entanto, mantenha a exposição à luz no mínimo necessário para preservar as células. Em seguida, configure o intervalo de tempo. O número de pontos temporais e o número de planos focais prosseguem com a aquisição de imagens conforme descrito anteriormente.

Para analisar os filmes, utilize um software de código aberto. O ImageJ com o plugin micromanager instalado pode ser usado. Filmes muito grandes também podem ser importados para o ImageJ utilizando o plugin loci. Este é um embrião selvagem capturado com óptica DIC, sem máscara.

O posterior está na parte inferior direita e o ventral na parte inferior esquerda. O vídeo mostra uma sequência de imagens de plano focal único coletadas a cada 15 segundos. A reprodução é configurada em 14 quadros por segundo.

Este embrião expressa fluorescência durante a primeira divisão embrionária, sendo o posterior representado no canto superior direito. Este vídeo mostra as alterações em um único plano focal a cada 10 segundos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter imagens de embriões vivos utilizando tanto a óptica DIC Naski quanto a fluorescência em epifluorescência para estudar eventos dinâmicos.

Esperamos que você tenha uma compreensão melhor de como configurar a óptica DIC Nomars para obter imagens ideais e perceba que é possível obter dados fluorescentes de alta qualidade utilizando iluminação por fluorescência em epifluorescência, sem depender sempre de microscópios mais avançados. Você também pode aplicar essas técnicas de imagem para examinar embriões que carecem de função gênica específica, a fim de investigar mais a fundo os requisitos genéticos para os eventos de seu interesse durante a divisão celular ou o desenvolvimento.