Mapeamento e Aplicação de Enhancer-trap Expressão Flippase em larval e Adultos Drosophila CNS

O objetivo geral do seguinte experimento é aperfeiçoar a expressão do GAL4 por meio do uso de lipase específica de tecido com ferramentas conversoras de GAL80. Isso é alcançado gerando uma coleção de linhagens transgênicas de moscas com armadilha de potenciador Philippe e determinando o padrão de expressão da lipase no SNC em cada linhagem. Utilizando imunoquímica com marcador GFP e relatórios GFP, é possível diferenciar a expressão glial da expressão neuronal para intersectar a expressão do GAL4 em linhagens de interesse, linhagens ET flip, ao longo das moscas contendo uma ferramenta conversora de GAL80 na prole.

A análise clonal pode ser utilizada para analisar o refinamento da expressão GAL quatro, como no olho. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que linhagens baseadas em faixas de potenciadores juntamente com ferramentas conversoras GAL 80 podem ser usadas com uma ampla coleção de alianças GAL quatro já disponíveis na comunidade de estudos com drosófila. Além disso, esse conceito pode ser expandido para outros organismos modelo emergentes GAL quatro UAS, como o peixe-zebra.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na mapeamento de circuitos neurais subjacentes ao comportamento. Embora este protocolo demonstre o uso da base flip em um subconjunto de células fotorreceptoras, o método interseccional pode ser aplicado à análise de outros tecidos, incluindo tecidos não neuronais. Conforme mais linhagens de lipase de armadilha de potenciadores forem caracterizadas.

A técnica GAL4-UAS é uma ferramenta importante amplamente utilizada por biólogos que trabalham com drosófilas. Uma limitação da maioria das linhagens GAL4 é que elas são expressas de forma muito ampla, o que impede seu uso no mapeamento de comportamentos cerebrais com os métodos baseados em promotores específicos. Antes de utilizar um transgene ET-FLP para restringir parcialmente a expressão de linhagens GAL4 em tecidos de interesse, não é possível ajustar com precisão a expressão do GAL4.

Primeiramente, é útil conhecer o padrão de expressão do transgene ET flip x dois em larvas em estágio avançado de desenvolvimento e em adultos, a fim de visualizar a expressão de flip a no SNC. Estabeleça um cruzamento entre machos portadores do transgene de interesse ET t flip X dois e fêmeas virgens que contenham um repórter GFP para a expressão de et flip. Colete larvas F1 de terceiro instar em fase de dispersão para dissecação. Coloque-as em uma placa S guard limpa e remova qualquer detrito com um pincel, enxaguando a placa uma vez com PBS 1x.

Agora, preencha a placa com PBS gelado em concentração uma vez para anestesiar as larvas. Para acessar o SNC de uma larva, segure seu gancho bucal com um par de pinças. Agarre a cutícula próxima à esfera anterior estendida e retire-a. O SNC permanece preso ao gancho bucal, juntamente com algumas outras estruturas.

Agora, com pinças, remova todas as estruturas excessivas que envolvem o SNC enquanto dissecar o SNC. Transfira-os individualmente para um recipiente Pyrex de três compartimentos preenchido com PBS. Após dissecar todos os SNCs, fixe-os submergindo-os completamente em 200 microlitros de PFA 4% sobre gelo.

Se um SNC flutuar, significa que não foi completamente limpo de todos os tecidos circundantes. Caso isso ocorra, use um par de pinças para remergulhar o SNC no fixador após a fixação por 15 minutos, lave o tecido com PBS gelado três vezes e, em seguida, lave o tecido mais três vezes com PBT gelado. O tecido agora está pronto para ser analisado por microscopia, marcado com anticorpos ou armazenado em PBT a quatro graus Celsius para uso posterior.

Coloração a partir do mesmo cruzamento utilizado para coletar larvas, colete adultos F1 antes da dissecação. Mergulhe cinco a 10 moscas e as refrigere em etanol 95% por 30 segundos para remover a cera da superfície da cutícula. Para remover o etanol, lave os adultos três vezes com PBS gelado a 1× e, após a terceira lavagem, transfira um deles para uma placa de 35 milímetros contendo PBS gelado a 1× para preparar um adulto para dissecação.

Coloque-o com o lado ventral voltado para cima e insira um alfinete minion no meio do abdômen. Inicie a dissecação utilizando uma pinça para remover as pernas. Em seguida, remova o cutículo da cabeça fixando-a nos props e, simultaneamente, descascando o cutículo de baixo do olho em direção ao topo da cabeça.

Usando cuidadosamente pinças afiadas, remova e retire os tecidos ao redor do cérebro, pois esses tecidos apresentam forte autofluorescência e fazem o cérebro flutuar durante a fixação. O cérebro é apenas uma parte do SNC adulto. A outra parte é o cordão nervoso ventral ou VNC no tórax, que também deve ser dissecado.

Primeiro, remova o cutículo torácico fixando a mosca na base da perna traseira e puxando suavemente o cutículo torácico até a base do pescoço. Segundo, para expor a cordão nervoso ventral, abra suavemente as duas metades do cutículo torácico. Terceiro, remova o abdômen do tórax fixando na base da segunda perna e puxando o abdômen para longe da região próxima ao primeiro esterno abdominal.

Em quarto lugar, limpe o CVC fixando na região umeral e removendo suavemente o tecido que envolve o CVC. Separe o anel de tecido conjuntivo ao redor da conexão cervical e continue removendo o tecido excedente enquanto coleta o cérebro. Em seguida, transfira o cérebro e o CVC, em forma de peras, para uma placa de Pyrex de nove poços contendo PBS gelado em concentração uma vez, mantido sobre gelo.

Para fixar os tecidos adultos, mergulhe-os em PFA 4% sobre gelo por 15 minutos. Após esse período, realize três lavagens com PBS gelado e três lavagens com PBT. O tecido está agora pronto para ser analisado por imagem ou marcado com anticorpos para analisar com precisão a expressão do transgene.

É útil marcar o SNC com marcadores neuronais ou glias para fornecer um referencial; comece incubando o tecido a quatro graus Celsius durante a noite com anticorpos contra neurônios ou glias no dia seguinte. Lave a preparação cinco vezes com PBT e incube com o anticorpo secundário fluorescente à temperatura ambiente por duas horas. Envolva a placa com papel alumínio para evitar o desbotamento fotossensível do anticorpo quando a incubação terminar.

Lave a preparação com PBS e monte-a inteiramente em uma lâmina. Utilize um anel de plástico OSHA para evitar que o tecido seja esmagado pelo lamínula. O sistema nervoso está agora pronto para ser examinado quanto aos padrões de expressão de GFP e LL em um microscópio de fluorescência.

Normalmente, três a cinco réplicas são analisadas para determinar a reprodutibilidade do padrão de expressão de flip. O padrão de expressão de flip na linhagem flip pode ser utilizado juntamente com outros transgenes para alterar a forma como o repressor GAL4, GAL80, é expresso. A alteração da expressão do repressor GAL80 é um método eficaz para realizar modificações.

Na expressão GAL quatro, um método consiste em remover a expressão GAL 80 com o transgene GAL 80, que inativa GAL quatro, o qual, caso contrário, induziria a degeneração ocular em todo o olho. A linha ET flip hash 6 88 A é utilizada aqui para avaliar a eficácia da ferramenta de conversão GAL 80 em um subconjunto de fotorreceptores na prole F1, comparando o fenótipo ocular ao fenótipo ocular das linhagens parentais. Qualquer evidência de deformidade ocular ou despigmentação confirma que o padrão de expressão flip está presente nos fotorreceptores e que a excisão de GAL 80 foi bem-sucedida.

Uma estratégia complementar não redundante é ativar a expressão de GAL80 utilizando a mesma linha de recombinação de interesse. Esta estratégia é muito semelhante à outra, mas agora a pigmentação e a degeneração ID na prole F1 são suprimidas. Em flip X dois.

Expressando fotorreceptores Uma vez dominada, a dissecação do SNC pode ser realizada em aproximadamente cinco minutos em adultos e um minuto em larvas, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante usar pinças afiadas para remover a traqueia e o tecido ao redor de ambos os adultos e de Libre C e Ss. É fundamental utilizar um recipiente livre de fixador para a dissecação. Atualmente, o choque térmico com sistema flip é usado para gerar clones aleatórios.

Por outro lado, o método enhancer trap flip permite gerar clones reprodutíveis, facilitando a análise morfológica e comportamental. Outra vantagem do método finger é que é possível restringir ainda mais os padrões de expressão do GAL4 utilizando linhagens adicionais baseadas em anan trap flip e outras linhagens gal. Uma limitação da configuração tubulin stop GAL80 é que certas combinações de GAL4 e efetores UAS, como LAG4 e UAS-KIR, não são compatíveis, pois causarão a morte das moscas.

Esse problema pode ser facilmente superado utilizando um efetor condicional UAS, como o UAS Shiri Ts, que permite examinar um comportamento em temperaturas restritivas, como esperado. Nem todas as linhagens de armadilhas de potenciadores para lipase expressarão níveis suficientemente altos de lipase para serem úteis. Apesar disso, a técnica dos dedos descrita aqui fornece uma nova abordagem para pesquisadores de drosófila aprimorarem a análise de mosaicos, seja para circuitos de desenvolvimento ou comportamento.