Procedimento para a Engenharia de pulmão

O objetivo geral deste procedimento é gerar tecido pulmonar em cultura que seja morfológica e fisiologicamente comparável ao tecido pulmonar nativo. Isso é realizado primeiramente colhendo o coração e os pulmões de uma rata adulta. O próximo passo é canular a artéria pulmonar e a traqueia e conectar os pulmões canulados a um biorreator para descelularização.

Após a descelularização e a lavagem, o pulmão é transferido para um biorreator de cultura estéril e preparado para o semeadura. O passo final do procedimento é semear o compartimento desejado do pulmão com uma população celular preparada. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a matriz extracelular descelularizada eficientemente repovoada com células que expressam marcadores pulmonares regionalmente específicos por meio de microscopia de imunofluorescência.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes de cultivo de células pulmonares in vitro é que as células mantêm fenótipos diferenciados por um período prolongado, permitindo que sejam estudadas por várias semanas em um substrato tridimensional de origem biológica. Para a descelularização, os pulmões são conectados à tampa do biorreator por meio da cânula vascular, e a tampa é conectada ao aparelho de descelularização. O frasco de vidro acima dos pulmões é mantido no lugar por um suporte com argola e preso com uma braçadeira.

Neste ponto, o material celular pode ser removido para produzir um suporte de matriz extracelular, que pode ser repovoado com material celular. A montagem do biorreator para semeadura e cultivo de tecido pulmonar engenheiro é mostrada neste diagrama. O conector com trava da cânula traqueal conecta-se a um circuito respiratório entre o reservatório da traqueia e a câmara principal.

O circuito respiratório inclui duas válvulas unidirecionais. Posicionadas de modo que o meio siga um caminho diferente ao entrar e sair do pulmão. Um pequeno reservatório é temporariamente incorporado à linha de perfusão para o cultivo de células endoteliais.

Uma bomba pulsátil é usada para transportar células do reservatório até o compartimento vascular do pulmão. A perfusão vascular é realizada utilizando uma bomba de roletes. O meio é perfundido na artéria pulmonar por meio da cânula acoplada, percorre a vasculatura pulmonar e sai pela veia pulmonar diretamente para o biorreator principal, onde o meio é aspirado para a perfusão.

O epitélio pulmonar é posicionado por injeção no circuito respiratório. A câmara principal, que contém o pulmão e o reservatório da traqueia, é utilizada para o cultivo prolongado do pulmão. Quando os pulmões são extraídos e a artéria e a traqueia são canuladas corretamente, os pulmões recém-extraídos devem reter ar sem vazamentos.

Isso pode ser verificado enchendo-os com ar enquanto estão submersos em líquido. Não deve haver bolhas indicando vazamentos de ar. Para iniciar o protocolo, os pulmões são inflados com PBS contendo nitroprussiato de sódio até que fiquem cheios, mas não sobreinflados; imediatamente, tampe a cânula traqueal para que os pulmões permaneçam inflados.

Em seguida, perfundir os pulmões com PBS e SNP por pelo menos 15 minutos a 15 milímetros de mercúrio. Depois disso, remover a tampa da cânula traqueal para permitir o desinflamento dos pulmões. Continuar a perfusão com PBS e SNP por 15 a 30 minutos, se necessário.

Reabasteça o PBS e o SNP para garantir que a pressão de perfusão seja mantida entre 10 e 15 milímetros de mercúrio. Para iniciar o procedimento de descelularização prolongada, a tampa do biorreator é conectada ao aparelho de descelularização. Em seguida, os pulmões são conectados à tampa.

Usando as conexões com trava de engate ligadas à cânula em formato de YS, a cânula da artéria pulmonar deve ser conectada à linha de perfusão e a cânula traqueal deve ficar suspensa livremente. Para garantir a descelularização completa do tecido, é fundamental manter o ar fora do sistema. As válvulas unidirecionais nas cânulas arterial e traqueal ajudam a remover bolhas de ar nos tubos, permitindo o fluxo reverso no tubo.

Portanto, permita que as bolhas de ar sejam removidas pela seringa e certifique-se de que todas as linhas estejam livres de ar. Inicie a perfusão com a solução de descelularização. Perfundido com a solução de descelularização.

Até que 500 mililitros de solução tenham perfundido através dos pulmões, a pressão ideal é inferior a 15 milímetros de mercúrio. Isso geralmente exigirá 2,5 horas. As taxas de fluxo geralmente são muito lentas no início e aumentam rapidamente durante a segunda hora para aproximadamente um mililitro por minuto ou mais.

Durante a perfusão, remova periodicamente o fluido de descelularização do biorreator, garantindo que permaneça fluido suficiente para sustentar o pulmão e a cânula traqueal. Quando a perfusão com o fluido de descelularização estiver completa, transfira os pulmões e o biorreator para uma cabine de cultura de tecidos. Para iniciar a lavagem do órgão, remova o frasco de 500 mililitros que contém o fluido de descelularização e substitua-o por um frasco estéril contendo até um litro de PBS estéril.

Use sucção a vácuo ou uma seringa para garantir que os tubos estejam livres de ar e perfunda PBS pela vasculatura a 10 a 15 milímetros de mercúrio da mesma forma. Quanto à descelularização, utilizando técnicas estéreis, remova periodicamente o PBS residual do biorreator e substitua ou reabasteça o frasco de PBS. Continue a lavagem com PBS fresco e estéril até que pelo menos 2,5 litros de PBS estéril tenham perfundido os pulmões.

Isso geralmente levará dois dias a partir do início do processo de descelularização, quando a lavagem estiver completa. Transfira os pulmões para um novo sistema de biorreator estéril contendo PBS fresco mais 10% de FBS mais 10% de penicilina-estreptomicina, garantindo que tanto todo o circuito de perfusão quanto todas as linhas da via aérea estejam completamente preenchidos com líquido. A partir deste ponto, uma bomba pulsátil será utilizada para perfundir os pulmões a cinco milímetros por minuto.

Esterilize o suporte de matriz extracelular pulmonar por perfusão noturna com PBS contendo 10% de FBS e 10% de penicilina-estreptomicina. Após concluir este passo, transfira os pulmões para uma incubadora a 37 graus Celsius por uma hora ou até que a temperatura esteja equilibrada. Em preparação para o tratamento com Ben Nase, o próximo passo é tratar os pulmões com Ben Nase.

Para remover o DNA remanescente de cada pulmão, preencha primeiro uma seringa de 10 mililitros apenas com o tampão Ben Nase pré-aquecido e uma seringa de 10 mililitros com 90 unidades por mililitro de Ben Nase diluído em tampão Ben Nase. Interrompa a perfusão dos pulmões.

Em seguida, insuflar a via aérea com o tampão Ben Nase, evitando injetar ar no pulmão. Deixar o pulmão desinsuflar por um minuto. Em seguida, insuflar o pulmão com a solução Ben Nase.

Novamente, tomando cuidado para não introduzir ar nos pulmões após a insuflação com Ben Nase. Deixe os pulmões repousar sem perfusão ou ventilação a 37 graus Celsius por uma hora. Ao final dessa hora, reinicie a perfusão com a solução de PBS contendo 10% de FBS e 10% de penicilina-estreptomicina já presente no biorreator e continue a perfusão durante a noite no dia seguinte.

Após a lavagem e esterilização, a matriz extracelular longa pode ser preparada para repovoamento celular. Substitua a solução de P-B-S-F-B-S benzo A por 250 mililitros de meio de cultura. Realize a perfusão por pelo menos uma hora antes da introdução das células e substitua por meio de cultura fresco imediatamente antes da semeadura das células.

Muitas fontes celulares podem ser utilizadas para o recobrimento de órgãos. Aqui, será demonstrado o recobrimento com uma população de células epiteliais. Primeiro, prepare uma seringa contendo 15 mililitros de uma suspensão celular da população desejada de células epiteliais.

Em seguida, encha o reservatório da via aérea com 80 mililitros de meio de cultura e certifique-se de que todas as linhas de ventilação estejam livres de ar. Depois, coloque o biorreator em uma incubadora de cultura tecidual a 37 graus Celsius e conecte a bomba de seringa para ventilação. Semee as células nos pulmões usando um bolus rápido único, injetando a suspensão celular de 15 mililitros na cânula traqueal.

Certifique-se de que os filtros de ar do biorreator principal estejam tampados. Em seguida, inicie imediatamente uma única respiração lenta utilizando a bomba de seringa para retirar 60 mililitros de ar do biorreator principal a uma taxa de três mililitros por minuto. Isso durará aproximadamente 20 minutos.

Deixe os pulmões em repouso estático por aproximadamente 18 horas após isso. Inicie a perfusão vascular lenta a cerca de 0,5 mililitros por minuto. Durante o cultivo de órgãos, a perfusão é geralmente realizada a uma taxa de um a três mililitros por minuto.

Usando uma bomba de roletes durante o cultivo epitelial, a ventilação é geralmente fornecida a uma taxa contínua de uma respiração por minuto e volume corrente de cinco a 10 mililitros. Usando uma bomba de seringa, o ar é ciclicamente retirado e injetado no biorreator para provocar a respiração, alternando entre pressão negativa e pressão atmosférica na câmara principal. Devido à necessidade de manter o biorreator hermético durante a ventilação, a ventilação deve ser pausada diariamente e o ar na câmara principal deve ser trocado.

Além disso, o meio deve ser trocado aproximadamente a cada três ou quatro dias. Durante o cultivo, cerca de metade do volume total deve ser substituído a cada vez no cultivo do epitélio pulmonar e do endotélio vascular. Na estrutura montada no biorreator, somos capazes de gerar tecido pulmonar capaz de participar da troca gasosa por intervalos curtos de tempo.

Uma coloração padrão de hematoxilina, eosina e tricrômio de pulmão nativo de rato é mostrada aqui para comparação com uma coloração H e E de um pulmão de rato descelularizado. A matriz extracelular descelularizada final deve estar completamente isenta de materiais celulares e manter as características macroscópicas, microscópicas e ultraestruturais do pulmão nativo. A coloração H e E permitirá a visualização de qualquer DNA residual aderido ao esqueleto como resultado de descelularização ou lavagem insuficientes, condições ideais para o plaqueamento celular e subsequente cultura do pulmão.

E o biorreator deve gerar células bem distribuídas em todos os cinco lobos do pulmão e deve proporcionar cobertura de aproximadamente 70% do arcabouço da matriz extracelular. Essas imagens comparam o pulmão nativo ao pulmão repovoado quando coradas por imunofluorescência. Para marcadores pulmonares principais, a população celular cultivada é positiva para a proteína secretória de células de Clara, proteína secretória pro C e aquaporina cinco.

Os marcadores de interesse são mostrados em vermelho e os núcleos corados com DAPI estão em azul em todos os painéis. Uma vez dominado este procedimento, da descelularização até a recolonização, ele pode ser realizado em quatro a cinco dias, se realizado corretamente.