Caracterizando Voláteis bacteriana secundária usando ionização Espectrometria de Massa (SESI-MS)

A ionização secundária por pulverização eletrostática, espectrometria de massas ou CS EMS permite a análise de voláteis bacterianos sem a necessidade de qualquer pré-tratamento da amostra. O espaço gasoso do cultivo bacteriano é deslocado por dióxido de carbono para dentro da câmara de reação CS SI. À medida que os compostos voláteis atravessam a câmara de reação SSI, passam pela nuvem de pulverização eletrostática e são ionizados.

Uma vez ionizados, os voláteis são conduzidos ao espectrômetro de massas para análise. O excesso de gás de arraste e os voláteis bacterianos não reativos passam por um filtro de 0,22 mícron para remover qualquer agente bacteriano, como medida adicional de proteção, sendo então liberados para um capuz químico. Em última análise, este protocolo de EMS fornece perfis voláteis bacterianos em minutos.

Prevê-se que esta tecnologia possa ser utilizada em diversas aplicações, incluindo a expiração, a análise do hálito para doenças infecciosas ou até em sistemas alimentares, onde poderíamos detectar rapidamente patógenos presentes nos alimentos. Existem várias vantagens principais nesta técnica em comparação com métodos existentes, como GCMS, espectrometria de massas e PT, RM S. Primeiramente, os compostos voláteis não requerem nenhum pré-tratamento antes da análise.

Segundo, é possível fragmentar íons específicos na mistura volátil, o que facilita a identificação dos compostos. E terceiro, é rápido. Normalmente leva menos de cinco minutos.

Para analisar cada amostra, escolha o recipiente apropriado para o crescimento do seu cultivo, considerando os requisitos de crescimento da espécie, bem como a entrega eficiente dos compostos voláteis ao espectrômetro de massas. Nesta demonstração, selecionamos frascos padrão de 100 mililitros para meio de cultura. Os voláteis bacterianos são conduzidos ao espectrômetro de massas por um fluxo de gás de arraste para montagem do sistema de transporte.

As linhas de gás devem ser conectadas às garrafas de cultura com tampas rosqueáveis que possuam pelo menos duas entradas para conexões. Insira as linhas de entrada e saída de gás nas entradas, e tampe quaisquer entradas adicionais antes de iniciar o cultivo das suas amostras. Pressurize os recipientes e submerja-os em água para verificar vazamentos.

Vazamentos de gás são uma causa primária de resultados atípicos na forma de sinais fracos ou ausentes. Os sinais iônicos voláteis aumentam durante a noite. Culturas de E. coli, K-12, e Pseudomonas aeruginosa, PAO1, em LB Lennox, preparando duas réplicas biológicas para cada espécie.

Prepare nove frascos estéreis de cultura contendo 50 mililitros de LB Lennox e um frasco não inoculado para ser usado como branco; inocule cada cultura de incubação prolongada em dois frascos de amostra. Criando réplicas técnicas, incube as culturas e o branco por 24 horas a 37 graus Celsius. Como o CEMS é especificamente projetado para amostrar voláteis, limite o uso de produtos de cuidados pessoais perfumados antes de utilizar o instrumento com rigor.

Tampe todos os produtos químicos voláteis no laboratório e controle ao máximo as correntes de ar durante os testes para evitar a contaminação do seu instrumento e das linhas de transferência de gás. Com agentes biológicos viáveis, instale filtros com o tamanho de poro apropriado na linha de gás de arraste. Os filtros não interferirão na transferência de compostos voláteis para a câmara de reação sesi, mas podem afetar ligeiramente a eficiência da transferência de aerossóis.

Para verificar se a fonte de tensão está desligada e se o sistema está descarregado de eletricidade, verifique as luzes indicadoras na fonte de tensão desligada. Certifique-se de que a tensão no multímetro seja zero e aterre os cabos elétricos. Neste momento, instale a solução de eletrosspray para análise.

No modo de íons positivos, utilizamos uma solução de eletrosspray contendo 0,1% de ácido fórmico, 5% de metanol e 94,9% de água. Para obter intensidade e estabilidade de sinal ideais, ligue o gás transportador de dióxido de carbono e ajuste a vazão para dois litros por minuto. Aplique pressão ao reservatório de eletrosspray para iniciar a entrega da solução de eletrosspray à câmara de reação a uma vazão de cinco nanolitros por segundo. Em seguida, ligue a fonte de tensão e ajuste a tensão para 2,5 quilovolts.

A tensão aplicada afeta a intensidade do íon sinal e a estabilidade do cone de eletrosspray para as tensões do nosso sistema entre dois e cinco quilovolts. Oferecem os melhores resultados no modo de íons positivos. Exercite cautela, pois neste ponto as superfícies metálicas da fonte de ionização são capazes de causar um choque perigoso. Agora, configure um método de calibração para monitorar o espectro de SEMS.

Desmarque a caixa de seleção de aquisição de múltiplos canais ou MCA. Defina o tempo de aquisição entre 10 e 15 minutos e inicie a aquisição de dados. Observe os espectros do fundo do gás de arraste e faça ajustes finos na tensão aplicada para obter um cromatograma de íons total estável e varreduras reprodutíveis.

Continue a coletar espectros e A TIC por cinco minutos para garantir que o instrumento esteja estabilizado com o instrumento assegurado. Insira os parâmetros de aquisição conforme apropriado para o seu experimento. Registre um espectro de fundo do gás de arraste para experimentos futuros.

Para coletar um espectro em branco. Direcione o fluxo do gás de arraste através das linhas de desvio e, em seguida, conecte a amostra em branco, com as válvulas fechadas, às linhas de transferência do instrumento. Abra as válvulas para o frasco da amostra e feche as válvulas das linhas de desvio.

Para espectros reprodutíveis. Deixe o sistema equilibrar por 30 segundos, período durante o qual a umidade na câmara de reação estará se estabilizando. Para garantir que o sistema esteja equilibrado, monitore a TIC, que mudará durante o período de equilibração seguido por estabilização.

Uma vez que o sistema esteja equilibrado, inicie a coleta do espectro. Após a coleta do espectro, remova o frasco da amostra abrindo primeiro as linhas de desvio do gás de arraste. Em seguida, feche as válvulas da amostra.

E, por último, remova o frasco da amostra. Passe gás de arraste pelo sistema por dois a quatro minutos para remover a umidade e os voláteis absorvidos das linhas de transferência e evitar contaminação cruzada entre amostras. Colete dados do perfil volátil de cada amostra bacteriana, coletando intermitentemente espectros adicionais em branco para garantir uma subtração adequada do branco.

Os perfis voláteis em modo de íons positivos para E. coli e P. aeruginosa, cultivados aerobiamente em caldo LB Lennox por 24 horas a 37 graus Celsius, são distintos. O espectro volátil de E. coli é dominado por um pico com razão massa/carga de 118, enquanto o espectro de Pseudomonas aeruginosa contém uma maior variedade de picos atribuíveis a proteínas.

Ao realizar este procedimento, é importante que você registre os parâmetros instrumentais que otimizou para sua análise, como a tensão aplicada, a composição da solução de eletrosspray e a taxa de fluxo do gás de arraste. Também é importante manter registros de seus espectros representativos para que possa reproduzir suas análises no futuro. Não se esqueça de que trabalhar com bactérias patogênicas e alta tensão pode ser extremamente perigoso.

Portanto, precauções como limitar o acesso ao CSS CMS durante o experimento devem sempre ser tomadas. Agora você deverá ser capaz de obter de forma reprodutível um CSS e espectros EMS para os voláteis bacterianos em seu sistema. Boa sorte.