Microchips de silício para Manipulação de célula-Interação

Olá, eu sou Elliot Hu. Sou pesquisador pós-doutorando no laboratório de Tia aqui no Instituto de Tecnologia de Massachusetts. Hoje vamos preparar culturas celulares em chips microeletromecânicos de silício. Os dispositivos parecem pequenos pentes que se encaixam e nos permitem manipular com precisão as interações entre duas populações celulares diferentes.

Hoje vamos estudar a interação entre hepatócitos hepáticos e células estromais de suporte. Especificamente, células fibroblásticas 3T3 são cultivadas na superfície superior dos pentes, de modo que, ao mover os dedos do pente, é possível deslocar as células e alterar sua disposição espacial. Cada dispositivo é dividido em duas partes que se encaixam em duas configurações possíveis.

O primeiro coloca as duas populações celulares em contato uma com a outra. O segundo separa ligeiramente as duas populações, de modo que as células não possam se tocar. Aqui, as interações por contato são impedidas, mas as interações por meio de fatores secretados são preservadas.

Vamos começar falando sobre como manipular as peças com pinças. Gosto de usar pinças de teflon maiores, bem como pinças metálicas menores com ponta redonda. Com as pinças maiores, você pode pegar as peças pelas bordas, assim, com as peças maiores; com os braços, é preciso ter cuidado para não quebrá-los, pois são muito frágeis.

Então você quer pegá-los na parte traseira da peça, assim. Com as pinças de metal, é possível alcançar o interior do orifício e pegar os chips diretamente. As peças maiores caberão na parede de uma placa de 12 poços, enquanto as peças menores caberão em uma placa de 24 poços ou podem ser pareadas com a peça maior.

Em uma placa de 12 poços, normalmente uso a pinça metálica. Quando manipulo as peças nas placas para encaixar duas partes, geralmente coloco a peça maior no poço primeiro e a empurro completamente para um dos lados. Em seguida, pego a peça complementar e a coloco no lado oposto do poço, empurrando-as juntas com duas pinças, uma em cada orifício.

Agora posso simplesmente travar as peças juntas, seja na configuração com espaço ou na configuração de contato. Se quiser separar as peças, prefiro puxá-las para a configuração com espaço e depois puxar verticalmente para cima para remover a peça. Os dispositivos são feitos de silício, portanto precisam ser revestidos para permitir a adesão adequada das células.

É provável que você receba os dispositivos já revestidos com poliestireno e tratados com plasma, portanto assumiremos esse como nosso ponto de partida. Primeiramente, utilizaremos colágeno para revestir a superfície à qual os hepatócitos se aderirão. Colocaremos os pentes de hepatócitos em uma solução de colágeno a 50 microgramas por mililitro e incubaremos a 37 °C por 45 minutos.

Os pentes de fibroblastos, por outro lado, não precisamos revestir. Após a incubação, aspiramos a solução de colágeno e lavamos com água. Agora vamos fixar os ES juntos em contato com partes complementares, de modo a formar uma superfície plana para o semeadura celular.

Primeiro, vamos encher algumas placas com etanol 70%. Vou colocar um par em cada poço e, em seguida, travá-los juntos. Após travar, queremos observar as peças ao microscópio para garantir que estejam coplanares.

De vez em quando, as peças podem travar desalinhadas. E no microscópio, você observará que estão em dois planos focais diferentes. Nesse caso, basta separar as peças e empurrá-las novamente juntas. Após verificar que o alinhamento está correto, deixamos as peças em etanol por algum tempo para esterilizar.

Muitas vezes estou com pressa, então simplesmente deixo de molho por 10 minutos. Após a esterilização, precisamos enxaguar. Aspire completamente o etanol e lave com água, depois aspire e lave novamente com água, e finalmente aspire a água e substitua pelo seu meio de cultura.

Agora vamos semear as células nos dispositivos. Normalmente, suspendemos as células numa concentração de 500.000 células por mililitro e pipetamos uma suspensão de um mililitro sobre cada par de pentes utilizando uma placa de 12 poços. Assim, semeamos os fibroblastos a 500.000 células por mililitro em dois dos poços.

Da mesma forma, preparamos uma suspensão de 500.000 hepatócitos por poço e os semamos nos outros dois poços. Agora, antes da incubação, vamos agitar bem as células para garantir que estejam uniformemente distribuídas. Gosto de agitar três vezes na vertical, três vezes na horizontal e depois repetir esse procedimento três vezes.

Após agitar, vamos colocá-lo no incubador e deixaremos as células repousarem por 15 minutos, momento em que vamos agitá-las novamente. Após agitar a cada 15 minutos durante uma hora, vamos então aspirar a suspensão celular e repicar para uma nova suspensão de células. E vamos repetir esse procedimento até obtermos uma camada confluente de células.

Normalmente com fibroblastos, são necessárias uma ou duas placações. E com hepatócitos, podem ser necessárias de duas a quatro placações. Para obter uma monocamada confluente, as células são plaqueadas em uma densidade bastante alta, e a agitação garante que as células sejam distribuídas uniformemente.

Após a primeira semeadura, forma-se uma camada esparsa de células. Observe que as células aderem apenas aos dedos que foram revestidos com poliestireno e colágeno. Após a semeadura de células frescas e incubação por mais uma hora, novamente com agitação a cada 15 minutos, a camada celular torna-se mais densa.

Após a terceira semeadura, temos uma boa densidade celular, e agora podemos parar depois que as células tiverem sido semeadas sobre os pentes. Desejamos manipular as células para a configuração experimental desejada. Os dispositivos são agora separados de suas partes complementares e incubados por 24 horas.

Após 24 horas, as células se espalharam formando uma monocamada confluente sobre a superfície dos pentes. Agora queremos formar um co-cultivo. O pente de hepatócitos e o pente de fibroblastos são agora transferidos para o mesmo poço e travados juntos na configuração inicial desejada.

Se desejado, após um determinado período de tempo, é possível alterar a configuração. Por exemplo, podemos passar para a configuração com folga após 18 horas; as peças são colocadas juntas, bem pressionadas, até que a configuração com folga seja alcançada e, em seguida, empurradas novamente em contato, retornando à configuração com folga.

E agora vamos remover um pente. O que vamos fazer agora é passar pelo processo de remoção da camada antiga de poliestireno, limpeza das lâminas e, em seguida, aplicação de uma nova camada de poliestireno e preparação para o cultivo celular. Mais uma vez, ao remover a camada antiga de poliestireno e aplicar uma nova camada, garantimos que nenhum resíduo do experimento anterior interfira em um novo experimento.

Então, após finalizar seu experimento, a primeira coisa que você deve fazer é tratar suas células com hipoclorito e depois enxaguar seus pentes e a água. Antes de colocar os chips no toing, você deve garantir que estejam completamente secos. Aqui temos alguns pentes que deixei expostos ao ar por algum tempo para secagem e estou verificando se estão totalmente secos.

E agora vamos pegar um pouco de toing e colocá-lo neste alto-falante de vidro. Vamos usar uma pipeta de vidro aqui para não dissolvê-lo. O Halloween dissolve plástico, então não podemos usar uma pipeta típica de poliestireno.

Certo, isso é o suficiente. Agora vamos pegar algumas dessas peças, colocá-las no toing e ligar o agitador para promover a agitação, cobrindo-o com papel alumínio para evitar que o tolueno evapore. Após duas horas, o tolueno deverá ter dissolvido a maior parte do poliestireno nos pentes, e então poderemos retirá-los e secar os pentes ao ar.

Após a lavagem de Halloween, as peças devem estar relativamente livres de poliestireno e relativamente limpas. No entanto, precisamos que as peças estejam extremamente limpas para que a nova camada de poliestireno adira bem, caso contrário elas não estarão suficientemente limpas. O poliestireno tende a descamar no meio do experimento quando as células começam a puxá-lo.

O que vamos fazer agora é uma limpeza com ácido piranha. Coloquei as peças em um béquer de vidro e vamos aquecê-las. Então, vamos colocar sobre uma placa aquecedora.

E aqui temos ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio. Vou despejar primeiro o ácido sulfúrico e, aqui, certifique-se de que todos os chips estejam imersos abaixo do líquido. Às vezes, eles têm a tendência de flutuar.

E também, agora que estamos trabalhando com produtos químicos bastante corrosivos, certifique-se de usar os equipamentos de proteção adequados. Aqui, estou usando luvas de nitrila. Agora vamos despejar o peróxido de hidrogênio no ácido e fique atento, pois trata-se de uma reação exotérmica.

Então, você pode ver que está liberando um pouco de fumaça enquanto reage, mas queremos adicionar energia ao sistema para torná-lo ainda mais reativo. Agora vamos aquecê-lo até 120 graus Celsius, cerca de 120 agora, de modo que você pode ter certeza de que quaisquer resíduos do seu cultivo celular serão completamente removidos de seus chips. Neste momento, você deve apenas deixar a reação seguir seu curso completo até que todo o peróxido de hidrogênio seja consumido.

E nesse momento, a mistura vai parar de borbulhar. Assim, a reação leva cerca de meia hora para completar-se. E após você deixar de ver as bolhas, basta desligar a placa de aquecimento e deixar esfriar.

E vamos transferi-los para uma curva de água BAK. E mais uma vez, certifique-se de estar usando pinças de teflon aqui, não metálicas, e você pode simplesmente pegá-las e transferi-las. Agora vamos enxaguá-las sob um fluxo contínuo de H₂O DD. Normalmente retiro diretamente do Meine e deixarei escorrendo por pelo menos 10 minutos aqui.

E ao fazermos isso, vamos lavar todas as traças de ácido após a piquetagem sob um fluxo de água por 10 minutos. O ácido deve ser completamente removido das lâminas, e vamos simplesmente armazená-las submersas em água até o momento em que estivermos prontos para revestir o poliestireno, poliestireno de peso molecular 45.000 que obtivemos da Sigma. E vamos pesar uma pequena quantidade dele aqui.

Temos 400 miligramas e vamos dissolvê-los em tolueno a 100 miligramas por mililitro. Portanto, o tolueno precisa ser manipulado na capela. E outra coisa é que, como vamos usar tolueno para dissolver poliestireno, queremos garantir que não utilizemos nenhum equipamento de proteção laboratorial feito de poliestireno.

Aqui estamos utilizando polipropileno, um tubo cônico e uma pipeta de vidro. Como tenho 400 miligramas de poliestireno, vou adicionar quatro mililitros de toing. Agora vamos agitar em vórtex por meia hora até que o poliestireno se dissolva. Agora vamos simplesmente agitar o tubo em vórtex na velocidade mais baixa por cerca de 20 minutos a meia hora.

Então, vou conectar o tubo aos vórtices. Não preciso segurá-lo o tempo todo. Após 20 a 30 minutos, o poliestireno deverá estar dissolvido e estaremos prontos para revestir.

Agora vamos realizar o revestimento por centrifugação do poliestireno em nossa instalação. Nosso centrífugo está em uma instalação de sala limpa. Aqui, precisamos usar touca, óculos de proteção, jaleco, sapatas e luvas, mas isso pode não ser igual na sua instalação.

Antes de usarmos este porta-peça, quero protegê-lo do poliestireno. Portanto, vamos cobri-lo com papel alumínio, e queremos deixá-lo o mais plano possível em relação à superfície, para que o chip possa assentar perfeitamente contra ela. Vamos fazer um pequeno furo bem no centro, para que possamos manter um vácuo no chip.

O spin coater é ajustado para 2.400 RPM e 30 segundos. Agora podemos pegar um dos nossos chips, posicioná-lo de modo que o centro do chip cubra o orifício, e inicialmente manter o vácuo desligado ao colocar o poliestireno, ligar o vácuo e, em seguida, iniciar a centrifugação. Para as partes menores, podemos aplicar um pouco menos de 10 gotas.

E para as peças maiores, são necessárias um pouco mais de 10 gotas de poliestireno. E vamos centrifugar por 30 segundos a 2.400 RPM. Agora vamos pegar os chips revestidos com poliestireno e colocá-los no forno a 120 graus C, temperatura acima do ponto de transição vítrea do poliestireno.

Portanto, isso vai refluir a superfície para suavizá-la um pouco, além de densificar e endurecer o plástico. Normalmente, deixo no forno durante a noite. Provavelmente, leva pelo menos algumas horas para que o processo se complete.

Após um cozimento prolongado durante a noite, os chips estão prontos para o tratamento com plasma. Agora vamos expor o poliestireno a um plasma de oxigênio, o que alterará a energia superficial, permitindo que proteínas e células adiram a ele de maneira mais eficaz. Assim, vamos simplesmente carregar os chips na câmara de plasma e reduzir a pressão até atingir o vácuo.

Um bom ajuste a utilizar é 200 mil, ciclo de vácuo e 200 watts de potência por um minuto sob um fluxo de gás oxigênio. Agora que o sistema foi evacuado, vamos introduzir o oxigênio. Ok, agora podemos ligar a potência de RF e gerar o plasma por um minuto.

Quando o plasma está em funcionamento, ele realmente brilha. É como uma lâmpada fluorescente. Após um minuto de exposição ao plasma, vamos restaurar a pressão até a atmosférica e poderemos retirar as peças.

Agora as partes estão prontas para o revestimento com proteína e para a alimentação celular. O objetivo ao projetar este dispositivo foi permitir que manipulássemos a microarquitetura do tecido de maneira dinâmica. Assim, a microorganização do tecido no organismo, especificamente a posição das células umas em relação às outras, é muito importante para determinar a função de cada célula específica em cultura laboratorial.

Até recentemente, não conseguíamos reproduzir isso adequadamente, mas nos últimos cinco ou dez anos, as pessoas começaram a conseguir micro-padronear células em um substrato de cultura de tecidos, posicionando exatamente onde desejamos as células em uma placa de cultura de tecidos. Ao fazer isso, conseguiram descobrir alguns aspectos importantes da biologia básica das interações célula-célula em escala microscópica. Agora, o que ainda não conseguimos fazer até este momento é realizar isso de forma dinâmica.

Isso significa alterar a organização de um cultivo celular no meio do seu experimento. E isso é importante porque, no organismo, o tecido não é um ambiente estático. Temos células que se movimentam e se reorganizam, particularmente durante a cicatrização de feridas ou o desenvolvimento.

Mas mesmo em um órgão normal em homeostase, há muita coisa se movimentando. O aspecto técnico mais difícil de aprender é exatamente como manipular fisicamente as partes. E inicialmente, quando você começar a trabalhar com o sistema, pode se sentir intimidado pela fragilidade das partes ou pelo tamanho reduzido dos movimentos que você precisa fazer.

Mas acho que, se você praticar um pouco com ele, não deverá ter muitos problemas. Alguns dos locais onde observamos esse dispositivo desempenhando um papel, por exemplo, no desenvolvimento embrionário, são aqueles em que as células entram em contato com uma série de ambientes celulares diferentes enquanto brotam através de várias camadas embrionárias. Sabe-se que as interações com cada uma das camadas, à medida que entram em contato sequencialmente, impulsionam as células cada vez mais ao longo de uma via específica de diferenciação.

E por isso acreditamos que esse tipo de dispositivo possa ser útil para tentar replicar esse tipo de evento em laboratório. Um dos aspectos da microorganização que especialmente queríamos analisar foi a diferença entre células se comunicando por interações por contato, nas quais as membranas celulares podem tocar uma na outra, versus fatores solúveis que são secretados no meio circundante e se difundem até uma célula que esteja um pouco mais distante. Muitas vezes, quando células estão em co-cultura e exercem efeitos mútuos, não ficou claro se essas interações são por contato ou se fatores secretados estão desempenhando o papel principal.