ampliPHOX Detecção colorimétrica em um Microarray de DNA para Influenza

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar um novo e rápido método de amplificação de sinal para detectar e caracterizar subtipos virais da gripe no chip de gripe, uma plataforma de microarranjo de baixa densidade. Isso é alcançado pela incorporação de DTPs biotinilados e pelo uso de iniciadores com uma extremidade fosfato no extremo cinco primo para amplificar o segmento do gene da matriz e um segmento do gene não estrutural a partir de extratos de RNA da gripe. A PCR é seguida por digestão enzimática e fragmentação para gerar um produto viral amplificado, monocatenário e biotinilado, que é então hibridizado à matriz após a hibridização.

A detecção Fox utiliza a fotopolimerização para gerar grandes manchas poliméricas nos locais onde ocorre hibridização, e padrões diferenciais de hibridização são usados para detectar subtipos virais da influenza. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como a detecção fluorescente convencional, é seu custo relativamente baixo e a obtenção de resultados rápidos, visíveis a olho nu, com sensibilidade analítica semelhante à da fluorescência. Embora este método possa fornecer informações sobre a caracterização de vírus da influenza utilizando o chip de gripe, por ser um método de detecção universal.

Ampl Fox também pode ser aplicado a uma ampla variedade de outros sistemas, como outros microarranjos de baixa densidade baseados em DNA e proteínas. Em teoria, qualquer produto biotinilado deveria poder ser detectado utilizando amox. O procedimento será demonstrado por Amber Taylor, cientista associada, e Kevin Moulton, assistente de pesquisa aqui na Endeavor, que ambos foram fundamentais no desenvolvimento do instrumento Fox e da química de detecção nos últimos anos.

Extraia o RNA viral de 200 microlitros de isolado viral utilizando um kit de extração de RNA viral e o protocolo do fabricante. Elua em um volume final de 60 microlitros e armazene os extratos a menos 70 graus Celsius ou abaixo para uso posterior. Em seguida, prepare a mistura mestra de R-T-P-C-R em gelo, conforme o protocolo do fabricante.

Usando uma mistura de dNTPS Biotinilados, adicione a mistura de iniciadores para o chip de flu, que contém as concentrações indicadas, ao meio mestre. Um iniciador de cada conjunto deve conter um grupo fosfato na extremidade cinco prima para facilitar a digestão enzimática. O conjunto de iniciadores para influenza A produz um produto de 1032 pares de bases, e o conjunto de iniciadores para influenza B produz um produto de 811 pares de bases.

Vortex brevemente e distribua 18 microlitros da mistura mestra em tubos PCR de parede fina. Em seguida, adicione dois microlitros do molde de RNA a cada tubo de reação. Transfira os tubos PCR para um termociclador e utilize um perfil de ciclagem com uma temperatura de anelhamento apropriada.

O perfil de ciclagem utilizado neste ensaio é mostrado aqui. Prepare a mistura de digestão enzimática combinando 2,2 microlitros do tampão de reação enzimática, 0,8 microlitros de água livre de nucleases e 1,0 microlitro da enzima lambda exonuclease por reação de PCR. Retire as amostras do ciclador térmico e adicione quatro microlitros a cada tubo de PCR.

Retorne as amostras ao ciclador térmico e programe o equipamento conforme indicado para 37 graus Celsius por 15 minutos, seguido por 95 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, aplique poços de hibridização de uso único ao redor das microarranjos a serem hibridizados. Depois, lave as lâminas em 110 mililitros de água purificada em um agitador orbital durante cinco minutos.

Seque as lâminas tocando suavemente com um lenço de papel na borda do poço. Combine 22 microlitros do tampão de hibridização 2x com cada um dos produtos de DNA de fita simples fragmentados, misture brevemente e pipete 40 microlitros nos poços do microarranjo. Deixe as lâminas hibridizarem por uma hora em uma câmara de umidade; após a hibridização, retire as lâminas da câmara de umidade e enxágue brevemente cada lâmina com dois mililitros do tampão de lavagem D. Coloque as lâminas em uma grade para lâminas.

Em seguida, adicione 110 mililitros dos tampões de lavagem A e B a recipientes separados utilizando um agitador orbital. Lave a grade de lâminas no tampão A a 60 a 90 RPM, a velocidade utilizada em todas as lavagens subsequentes, durante um minuto. Em seguida, remova a grade de lâminas do tampão de lavagem A e enxágue brevemente com o tampão de lavagem D. Transfira a grade de lâminas para o tampão de lavagem B e lave no agitador orbital por cinco minutos.

Após a lavagem, seque cuidadosamente os arranjos em cada lâmina com um lenço de papel e coloque as lâminas secas na câmara de umidade. Em preparação para as etapas de detecção colorimétrica, combine 10 microlitros de amplitude, 20 microlitros de tampão de amplitude 2x e 10 microlitros de água purificada para cada arranjo a ser processado, transfira 40 microlitros da mistura de marcadores para cada arranjo e deixe a reação de marcação prosseguir em uma câmara de umidade fechada por cinco minutos. Durante a hibridização, prepare 110 mililitros do tampão de lavagem C em um recipiente. Após a marcação, enxágue imediatamente cada arranjo com o tampão de lavagem D. Coloque cada lâmina no suporte para lâminas e lave no tampão de lavagem C em agitador orbital por cinco minutos; após a lavagem com o tampão C, mergulhe brevemente o suporte para lâminas três vezes em um recipiente contendo água purificada.

Para remover resíduos de sal, seque as matrizes conforme mostrado anteriormente. Armazene as matrizes em uma caixa de lâminas escura até a fotoativação e a aquisição de imagens, que devem ser concluídas dentro de 24 horas. Em seguida, ligue o leitor Amli Fox e certifique-se de que o software Amli View esteja pronto para a fotoativação antes da detecção da amostra da matriz.

Primeiro, determine o tempo ótimo de ativação fotográfica para todas as amostras seguindo um breve procedimento de calibração. Uma vez por uso diário, aqueça a solução Amplify até a temperatura ambiente e vortexe brevemente para homogeneizar; pipete três microlitros do amplificador no frasco de Amplify e vortexe completamente. Por 10 segundos, aplique uniformemente 40 microlitros da solução Amplify em apenas uma lâmina por vez, garantindo que não haja bolhas presentes.

Insira a lâmina de microarranjo na câmara de fotoativação do Amplify Reader. Inicie a fotoativação selecionando "iniciar" no software da vista PL, utilizando o tempo de fotoativação determinado no processo de calibração. Após a conclusão, lave o microarranjo com dois mililitros de água purificada para remover o excesso de polímero Amplify Clear. A formação do polímero já ocorreu nas manchas que contêm o DNA alvo, mas é melhor visualizada após essa etapa.

Após a coloração, deixe as manchas de polímero secarem por dois minutos. Em seguida, distribua duas gotas de amply red sobre a matriz e deixe a coloração prosseguir por dois minutos. Após a coloração, enxágue rapidamente a lâmina com água purificada e seque conforme mostrado anteriormente; insira a lâmina na câmara de imagem do leitor Amli Fox para coletar uma imagem, utilizando o software amli para processar os resultados. A imagem à esquerda mostra a detecção de uma amostra do novo H1N1 de 2009 pelo Amli Fox.

Embora a imagem à direita utilize fluorescência tradicional gerada por um scanner microarranjo de fluorescência confocal, o mesmo padrão geral de detecção pode ser facilmente observado em ambos os métodos. No entanto, o resultado do Amli fox é visível a olho nu. Essas imagens mostram os resultados do flu chip de origem humana, H três N dois de origem humana, H um N um, de origem suína, H um N um, e um arranjo fox negativo sem detecção de influenza.

As sequências dois e três destacadas em azul produzem sinal para todos os subtipos de influenza mostrados, mas as sequências destacadas em vermelho no canto inferior direito produzem sinal apenas para o espécime de origem suína, H um N um. O espécime negativo mostra sinal em uma sequência de controle interno destacada em verde, indicando ausência de inibição ou falha na reação de R-T-P-C-R.

Uma vez dominado, todo o processo, desde a extração do frasco até a detecção de amox e a interpretação do resultado final, pode ser realizado em aproximadamente seis horas. A etapa de detecção Ampl Fox do procedimento, incluindo a calibração do instrumento, pode ser concluída em cerca de 30 minutos após este procedimento. Outros métodos, como o sequenciamento parcial ou completo do genoma, podem ser realizados para responder perguntas adicionais.

Este ensaio de influenza destina-se a um rastreamento inicial, particularmente para amostras que resultam em um padrão de hibridização único. Como a detecção é um ensaio geral, esperamos que os pesquisadores encontrem novas e interessantes aplicações de microarranjos de baixa densidade nas quais a detecção possa agregar valor.