Imagens ao vivo de extrusão celular da epiderme de Zebrafish desenvolvimento

A manutenção dos tecidos epiteliais requer a remoção contínua de células danificadas e moribundas sem comprometer a função de barreira. Para isso, o epitélio extrai as células moribundas formando e contraindo um anel de actina e miosina na célula que circunda a célula moribunda, expulsando-a ao mesmo tempo em que fecha eventuais lacunas resultantes de sua saída. Neste artigo em vídeo, apresenta-se um método para induzir e imaginar em tempo real a extrusão de células apoptóticas da epiderme de larvas de peixe-zebra.

Isso é demonstrado pela injeção de uma sonda de filamentos de actina marcada com proteína fluorescente vermelha em embriões de peixe-zebra transgênicos de um estágio celular que expressam a proteína fluorescente verde na epiderme, a fim de visualizar os filamentos de actina em tecidos epiteliais. Larvas do quarto dia pós-fecundação que expressam tanto GFP quanto RFP são então tratadas com G418 para induzir apoptose na epiderme. A dinâmica da actina e as alterações na forma das células epiteliais que ocorrem durante a extrusão são visualizadas por meio de imagens de lapso de tempo em um microscópio confocal de disco giratório.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como forças imunológicas e análises, é que podemos observar alterações rápidas e a dinâmica da actina que ocorrem durante o processo de extrusão em um tecido epitelial vivo. Neste vídeo, mostraremos um procedimento para a obtenção de imagens em tempo real da extrusão de células apoptóticas da epiderme de peixes-zebra em desenvolvimento. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para compreender como as células rearranjam coordenadamente seu citoesqueleto de actina para remover células apoptóticas mantendo a função de barreira, e como a interrupção do processo de extrusão pode levar a certos estados patológicos.

Então vamos começar. Para visualizar a dinâmica da actina durante a extrusão celular na epiderme de embriões de peixe-zebra em desenvolvimento, comece descongelando o RNA transcrito previamente em gelo. Transcrevemos mRNA que codifica uma proteína fluorescente vermelha fundida ao domínio de homologia de calpina do utrofina e da proteína ligadora de actina. Adicione fenol vermelho ao RNA numa proporção de um para um, obtendo uma concentração final de RNA de aproximadamente 30 nanogramas por microlitro, e carregue um microlitro da solução em uma micropipeta de vidro puxada por meio de preenchimento reverso.

Colete cerca de 75 embriões C-K-G-F-P em estágio de uma célula em tampão E três. Pipete os embriões coletados para dentro do molde de microinjeção com uma pipeta de pasta cinco e três quartos e oriente suavemente os embriões no sulco com pinça FST Dumont número cinco. Trabalhe rapidamente para evitar a necessidade de injetar o RNA em embriões de múltiplos estágios sob um microscópio estereoscópico de dissecação laboratorial padrão.

Utilize um microinjetor controlado por pressão para injetar o RNA no vitelo dos embriões como fóssil de fenol. O vermelho deve ser visível no embrião após a injeção. Certifique-se de injetar pelo menos 50 embriões para cada experimento.

Selecione os embriões para remover quaisquer ovos não fertilizados ou danificados e incube todos os embriões restantes a 28 graus Celsius. Após 24 horas, utilize um microscópio estereoscópico fluorescente para selecionar embriões de peixe-zebra que apresentem alto nível de fluorescência GFP na epiderme e fluorescência de actina marcada com RFP. Incube os embriões selecionados a 28 graus Celsius até que estejam prontos para prosseguir com o tratamento farmacológico para induzir apoptose pela exposição ao aminoglicosídeo.

O antibiótico G quatro 18 ou medicamento provoca a extrusão de células apoptóticas do epitélio das larvas em desenvolvimento de peixe-zebra. Importante, este tratamento só funciona em larvas com quatro dias pós-fertilização ou mais velhas para induzir a extrusão celular. Colete até 25 larvas de peixe-zebra de quatro dias pós-fertilização que expressem tanto GFP quanto RFP em uma placa de cultura de 35 por 10 milímetros contendo três mililitros de meio E três.

Substitua cuidadosamente o meio por três mililitros de E três contendo um miligrama por mililitro de G quatro 18 e incube a larva no fármaco por quatro horas no escuro a 28 graus Celsius. Em seguida, remova o meio e substitua por meio E três pré-aquecido contendo 0,02% de trica e prossiga para o acondicionamento das larvas para a obtenção de imagens. Transfira até três larvas para um tubo fendor de 1,5 mililitro e remova a maior parte do meio E três.

Usando uma ponteira cortada, pipete 120 microlitros de agarose a 1% de baixo ponto de fusão para dentro do tubo e misture. Em seguida, pipete suavemente a mistura de larvas e agarose sobre o lamínula na base de uma placa de cultura Matech. Utilizando um suporte de agulha FST com uma agulha inserida ou uma agulha de tungstênio acoplada, oriente rapidamente as larvas para que fiquem retas e planas contra o lamínula.

Deixe o aose solidificar. Em seguida, encha suavemente o recipiente com meio E três médio contendo 0,02% de trica. Descobrimos que todo o processo de extrusão de células apoptóticas da epiderme das larvas de peixe-zebra em desenvolvimento leva aproximadamente 20 minutos.

Aqui demonstramos como configurar um experimento de imagem com lapso de tempo utilizando um microscópio confocal de disco giratório e o software and or IQ para coletar uma série temporal de planos Z através de uma única camada do epitélio de peixe-zebra. Primeiro, ligue os lasers de argônio e hélio-neônio, a câmera do microscópio e a lâmpada fluorescente epiluminescente dentro do software and or IQ. Crie um protocolo de série temporal contendo os comprimentos de onda a serem imageados.

A frequência dos intervalos entre as capturas de imagens e o número de vezes que a captura deve ser repetida. Coloque suavemente a placa mattec contendo o espécime sobre a platina do microscópio e, em seguida, utilize uma objetiva de 20 vezes com luz transmitida para focalizar as larvas. Posicione corretamente a objetiva de imersão em água de 40 vezes. Com esta objetiva, podemos filmar aproximadamente 20 a 25 células por campo, o que nos permite acompanhar os comportamentos celulares durante a extrusão, além de resolver dinâmicas subcelulares do actino.

Coloque cuidadosamente uma gota de água sobre a objetiva de 40 vezes e posicione rapidamente o recipiente Mattec por cima. Identifique o espécime utilizando iluminação em campo claro e, em seguida, use fluorescência epiluminiscente de 488 nanômetros para focar especificamente na epiderme positiva para GFP. Alterne para o modo de varredura confocal.

Ajuste a intensidade do laser e o tempo de exposição para cada um dos canais conforme necessário. Tenha cuidado para equilibrar a potência do laser e o tempo de exposição para uma detecção ideal do seu sinal e para evitar qualquer fototoxicidade. Para identificar células em extrusão, utilize fluorescência epipiluminiscente para visualizar a epiderme marcada com GFP e identifique um grupo de células em um padrão de roseta clássico, consistindo em um aglomerado de células ao redor de uma pequena célula redonda no centro.

Além disso, deve haver uma acumulação da actina marcada com RFP visível como um anel ao redor da pequena célula redonda no centro, uma característica marcante da extrusão celular. Uma vez identificada uma célula em extrusão, defina rapidamente os limites superior e inferior para a série Z e o tamanho do passo. Em seguida, comece a adquirir quatro conjuntos de dados confocais em 4D para visualizar os dados e observar a contração do anel de actina e os comportamentos epiteliais que ocorrem ao redor da célula moribunda.

Com o passo do tempo, faça projeções 3D da série Z e salve os dados como um arquivo de vídeo. Esta etapa pode ser realizada utilizando diversos pacotes de software. Esta figura mostra a expressão de RFP UTR CH na epiderme de larvas de peixe-zebra CK GFP com quatro dias pós-fertilização.

Aqui, as projeções de quadros fixos de um filme com lapso de tempo seguem a dinâmica de atina em tempo real. Durante o processo de extrusão de células epiteliais, as setas indicam o anel de actina formado por células vizinhas, que se contrai e fecha ao longo de dois minutos. Após este procedimento, podemos usar outros métodos em combinação com esta técnica, como o uso de inibidores químicos ou mutações genéticas, para compreender melhor como a alteração da extrusão pode levar a certos estados de doenças.

Decorrente da falha no clearance de células apoptóticas, acabamos de mostrar como montar um experimento de imagem em lapso de tempo para visualizar o processo de extrusão a partir da epiderme do peixe-zebra em desenvolvimento. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de limitar a quantidade de luz a que seu espécime é exposto para evitar qualquer fotodesbotamento ou toxicidade. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.