Caracterização do isolado, ventilado, Lung Mouse e Instrumentados perfundidos com fluxo pulsátil

Para estudar as relações pressão-fluxo pulsáteis no pulmão. Este protocolo descreve como isolar, ventilar e perfundir pulmões de camundongo. A traqueia é exposta cirurgicamente para ventilação.

Em seguida, o coração e os pulmões são isolados para que a artéria pulmonar e a aurícula esquerda possam ser canuladas. O sistema pulmonar é então perfundido. Os experimentos são realizados alterando o fluxo, a magnitude, a forma de onda e/ou a frequência da artéria pulmonar.

As formas de onda resultantes da pressão da artéria pulmonar e da aurícula esquerda são registradas e demonstram as relações entre pressão e fluxo pulsáteis no sistema pulmonar. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como preparações in vivo, é a possibilidade de observar alterações nas relações entre pressão e fluxo. As relações pulsáteis entre pressão e fluxo podem ser obtidas na ausência de mudanças no status de volume, no tônus do sistema nervoso simpático, na atividade e nos efeitos da anestesia.

Além disso, a maioria das preparações pulmonares isoladas mede apenas relações pressão-fluxo em estado estacionário, enquanto nossa técnica permite determinar relações pressão-fluxo pulsáteis. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da fisiologia pulmonar, como, por exemplo, como a doença vascular pulmonar afeta a hemodinâmica pulmonar pulsátil ou como o enrijecimento da artéria pulmonar de grande calibre afeta a pós-carga do ventrículo direito? A demonstração visual deste método é essencial, pois expor o coração e os pulmões e fixar a cânula na artéria pulmonar são procedimentos difíceis de aprender.

A pressão excessiva proveniente da instrumentação pode causar edema nos pulmões e a colocação inadequada da cânula pode perfurar a artéria pulmonar. Antes de iniciar o experimento, é necessário preparar o sistema IL um usado para ventilar e perfundir o pulmão isolado. As tubulações devem ser conectadas aos transdutores de pressão.

Use a bomba solitária e o medidor de fluxo para enxaguar completamente o sistema com água destilada aquecida a 37 graus Celsius e remova todas as bolhas presentes no tubo. Em seguida, prepare o tubo da bomba Endur tech com PBS a 1%. Agora, zere o sistema.

A pressão de cada transdutor P 75 deve ser ajustada primeiro fechando sua válvula em relação ao sistema IL e abrindo sua válvula para a atmosfera. Em seguida, utilize o amplificador plug SIS para zerar automaticamente a pressão antes de preparar o animal. Umidifique o conjunto IO um molhando a peça cerâmica porosa em água destilada. Após anestesiar o camundongo, estabilize-o para a cirurgia fixando suas patas dianteiras em uma cortiça.

Agora, pulverize o tórax com álcool a 95%. Use pinça reta para segurar a pele no pescoço e faça uma abertura de um centímetro com a tesoura reta. Uma vez exposto o interior do pescoço, remova o tecido glandular branco dos músculos superficiais enquanto procura o esôfago e a traqueia.

Isolese o esôfago e a traqueia do tecido em ambos os lados e posteriormente e amarre um ponto solto ao redor da traqueia. Para canular a traqueia, corte cuidadosamente um pequeno V em um dos lados com a tesoura pequena. Agora leve o camundongo ao sistema IL um usando pinça romba.

Segure a cânula traqueal e deslize-a para dentro da traqueia. Fixe a cânula com um ponto de sutura. Inicie a ventilação com ar ambiente primeiro, pulverize o tórax com álcool e remova a pele utilizando pinças retas e tesoura reta.

Corte a pele no sentido ascendente ao longo do esterno. Levante a pele em cada lado e corte ao longo da linha das costelas inferiores. Agora, segure o processo xifoide com pinça e use uma tesoura de ponta redonda para fazer um orifício no diafragma onde ele se encontra com a extremidade inferior do esterno.

Segure o diafragma e corte-o afastando-o das costelas. Usando uma tesoura de pontas arredondadas, segure novamente o processo xifoide e utilize a tesoura de pontas arredondadas para cortar cuidadosamente o esterno através das costelas, sem danificar os pulmões, o coração ou os vasos sanguíneos. Para expor o coração, segure as costelas esquerdas e corte as pontas delas.

Agora, injete lentamente 0,1 mililitros de heparina no ventrículo direito. Após a injeção, corte o restante das costelas. Use a parte traseira ou a extremidade arredondada da pinça para empurrar suavemente os pulmões para longe da costela enquanto corta as costelas sob um microscópio. Remova o tecido glandular na gordura localizada acima do coração.

Use a pinça para afastar os tecidos e removê-los. Com a tesoura de mola, coloque um fio de sutura ao redor da aorta e da artéria pulmonar, retirando delicadamente o coração com uma pinça romba. Deve haver pouca resistência.

Agora, dê um ponto solto com o laço duplo. Em seguida, remova o abdômen inferior. Use tesoura angulada para cortar através das costelas e da coluna vertebral.

Isso fará com que uma quantidade significativa de sangue flua. Use um cotonete para estancar o fluxo. Uma vez que o fluxo sanguíneo for interrompido, prepare o sistema IL com quatro mililitros de RPMI a partir de uma seringa preenchida com 10 mililitros de RPMI.

É recomendável verificar novamente se a tubulação não contém bolhas. Agora, canule o ventrículo direito fazendo um pequeno corte próximo ao ápice e inserindo a cânula, direcionando-a para baixo, em direção ao lado direito, para alcançar a artéria pulmonar. A ponta da sonda deve ser visível através da parede quase transparente da artéria pulmonar.

Em seguida, aperte o sutura ao redor da cânula, aorta e artéria pulmonar para canular o ventrículo esquerdo. Faça um entalhe no ápice e insira a cânula direcionada para cima, em direção ao átrio esquerdo. Pode ser necessária uma leve pressão para localizar a válvula, mas, uma vez encontrada, a cânula deslizará através dela e ficará firme sem necessidade de sutura.

Infunda manualmente o RPMI da seringa de 10 mililitros a 0,3 mililitros por minuto até observar fluxo no tubo de saída. Se não houver fluxo no tubo de saída, reposicione a cânula do ventrículo esquerdo. No entanto, se não houver fluxo nos pulmões, aborte o experimento, pois provavelmente há um vazamento na artéria pulmonar.

Agora que o coração está totalmente cânulado, conecte a seringa de 60 mililitros ao sistema IL um. Utilizando a bomba de fluxo constante, infunda o RPMI Perfuse oito a uma taxa de um mililitro por minuto. Verifique a presença de vazamentos durante a perfusão inicial.

Perfusar gradualmente os pulmões por mais dois minutos, durante os quais os pulmões ficarão brancos. Para estudos de fluxo pulsátil. Primeiro, ajuste o deslocamento do pistão da bomba solitária nos níveis desejados.

Em seguida, ajuste a taxa de fluxo constante. Agora, abra a válvula da bomba osli e comece a gravar os dados logo antes de executar o perfil de fluxo osli. Quando terminar, abra o arquivo de saída de dados e trace o fluxo experimental com base nos fluxos experimentais do ensaio inicial.

Ajuste o deslocamento do pistão da bomba oscilatória em cada frequência para que Q máx seja o desejado. Mantenha a ventilação em pressão constante. Durante a coleta de dados para os ensaios de fluxo constante, feche a válvula da bomba isolada e ajuste a taxa de fluxo constante ao nível desejado. Inicie o registro de dados e prossiga com o protocolo de fluxo constante.

Coletar dados por pelo menos 10 segundos em cada taxa de fluxo entre os ensaios. Reajustar a taxa de fluxo para 0,5 mililitros por minuto. Certifique-se de manter a ventilação em pressão constante durante a coleta de dados.

Se forem desejados ensaios com pressão atrial esquerda zero, remova o tubo de saída durante a realização dos ensaios. Observe atentamente a presença de RPMI no tubo da via aérea. O RPMI não deve atingir os transdutores de pressão da via aérea, pois eles serão danificados.

Aqui estão os resultados da perfusão com fluxo constante com fluxo Q na primeira linha e as pressões resultantes na artéria pulmonar e na aurícula esquerda na segunda linha sob uma variedade de condições. Nos dois primeiros painéis, a pressão na aurícula esquerda aumentou e diminuiu com Q porque o tubo de saída estava no lugar; o primeiro painel mostra a pressão aérea no final, pressão inspiratória, e o segundo mostra a pressão aérea no final da pressão expiratória. Em seguida, o tubo foi removido, de modo que a pressão na aurícula esquerda permaneceu constante e independente de Q. Depois, a altura do tubo de saída foi ajustada manualmente para que a pressão na aurícula esquerda fosse mais alta.

Mas independentemente de Q novamente, o primeiro painel mostra a pressão aérea ao final, a pressão inspiratória, e o segundo mostra a pressão aérea ao final da pressão expiratória. As relações resultantes entre pressão e fluxo na artéria pulmonar para cada caso podem ser obtidas plotando-se a pressão versus o fluxo.

Aqui estão os resultados da perfusão com fluxo pulsátil com fluxo Q no painel superior e as pressões resultantes na artéria pulmonar, átrio esquerdo e pressões aéreas. No painel inferior. A partir dessas relações pressão-fluxo pulsáteis pulmonares, pode-se calcular a impedância vascular pulmonar, que reflete a pós-carga total do ventrículo direito.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 20 a 30 minutos. Ao tentar este procedimento, é importante ter calma e relaxar para que suas mãos permaneçam firmes. Uma vez que os pulmões sejam adequadamente perfundidos, a parte difícil já terá terminado.

Após este procedimento, outras técnicas podem ser realizadas, como histologia ou ensaios bioquímicos no tecido pulmonar, para responder perguntas adicionais, como quais mecanismos moleculares são responsáveis pelas alterações observadas nas relações pressão-fluxo pulsátil pulmonar. Esta técnica abre caminho para pesquisadores na área da fisiologia pulmonar explorarem o papel de genes e proteínas específicas no desenvolvimento e na progressão da doença vascular pulmonar utilizando camundongos geneticamente modificados.