Transmembrana Propensão Oligomerização Domínio determinado pelo Assay ToxR

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar as propensões de ligamentização de proteínas, domínios transmembrana ou T MDs em um ambiente de membrana natural. Isso é alcançado pela expressão do domínio transmembrana de interesse em *E. coli* como uma proteína quimérica com a proteína de ligação à maltose para localização no periplasma e ToxR como repórter transcricional; a ligamentização induzida pelo domínio transmembrana resulta na dimerização do ToxR e na ativação da transcrição de LXi. Em um segundo passo, as células são lisadas e tratadas com ONPG, que é hidrolisado pela beta-galactosidase à espécie absorvedora de luz O-nitrofenolato ou ONP.

Os próximos níveis de ONP são quantificados medindo-se a absorbância da luz em 405 nanômetros. Para determinar os níveis do domínio transmembrana, os resultados da ligamentização revelam a propensão à ligamentização dos domínios transmembrana com base em um ensaio com repórter tox R. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos biofísicos existentes, como eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS ou fluorescência, é que o comportamento do domínio transmembrana é estudado em uma bicamada fosfolipídica natural por meio da expressão em *E. coli*, em vez de em um sistema mimético de membrana, como um detergente micelar.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de proteínas de membrana, como a elucidação de características estruturais-chave envolvidas na associação de hélices transmembrana. Antes do início deste protocolo, sete plasmídeos expressando a proteína quimérica necessária são preparados a partir de oligonucleotídeos sintetizados comercialmente, representando a TDS de interesse flanqueada por NHE um e BMH um. Após a preparação dos plasmídeos, descongele suavemente células competentes fhk 12 no gelo. Assim que descongeladas, transfira as células para tubos de cultura de 15 mililitros, adicionando 200 nanogramas de cada DNA plasmidial a um tubo separado e incube as células no gelo por 30 minutos.

Em seguida, submeta as células a um choque térmico por 90 segundos a 42 graus Celsius, seguido por incubação em gelo por dois minutos em 800 microlitros de meio SOC e incube as amostras a 37 graus Celsius com agitação por uma hora; após a incubação, inocular cinco mililitros de meio LB contendo cloranfenicol e aose com 50 microlitros da mistura de transformação usando tubos de cultura de 15 mililitros em triplicata para cada amostra. Por fim, incube as amostras a 37 graus Celsius com agitação por 20 horas. Para medir a total ligamentização, a atividade da beta-galactosidase TDS é determinada.

Primeiro, pré-aqueça o leitor de placas a 28 graus Celsius. Use o estoque tampão Z para preparar soluções frescas de tampão Z conforme descrito no protocolo escrito. Transfira o clorofórmio do tampão Z do tubo para o reservatório, certificando-se de pipetar apenas a camada aquosa superior do clorofórmio do tampão Z.

Coloque a placa de 96 poços sobre uma folha de papel com uma grade desenhada para garantir a transferência precisa de 100 microlitros do tampão Z com clorofórmio para cada poço de uma placa de 96 poços, seguido por cinco microlitros de cada cultura em quádruplo. Em duplicata, omita a cultura dos quatro poços que servirão como brancos. Meça a DO 5 95 da placa para determinar a densidade celular.

Adicione 50 microlitros de tampão Z SDS a todas as poças da placa. Em seguida, agite a placa no leitor de placas durante 10 minutos para lisar as células após a lise celular com 50 microlitros de ZPA para ONPG em todas as poças. Retorne a placa ao leitor de placas e meça a DO 4 0 5 a cada 30 segundos durante 20 minutos.

Determine o nível de atividade da beta-lactosidase por meio de um cálculo de unidades de Miller normalizadas em relação ao branco. A eletroforese em gel com transferência (Western blotting) é realizada para verificar a expressão proteica equivalente entre os construtos. Primeiro, combine 50 microlitros das culturas em triplicata e, em seguida, centrifugue as amostras utilizando uma microcentrífuga.

Remova o sobrenatante por pipetagem e ressuspenda. Suspenda o pellet residual em tampão de carregamento de amostra 2x, carregue 7,5 microlitros de cada amostra em um gel padrão de 8% e realize a eletroforese a 125 volts por uma hora e cinco minutos após a transferência. Incube a membrana com anticorpo conjugado anti-M-V-P-H-R-P para visualizar a proteína quimérica, observada em aproximadamente 70 kilodaltons, com alguns produtos de degradação às vezes vistos em torno de 48 kilodaltons.

A MVP endógena também é observada em 45 kilodaltons. Para avaliar a inserção adequada na membrana da construção quimérica de TMD, utiliza-se a linhagem celular PD 28 deficiente em proteína de ligação a maltose, que, quando cultivada em meio mínimo com maltose como única fonte de carbono, permite o crescimento apenas de células que expressem um produto de expressão integral na membrana com a proteína de ligação a maltose corretamente localizada no periplasma. Transforme as células PD 28 conforme descrito para as células fhk 12 e inocule dois mililitros de meio LB.

Cultive as células a 37 graus Celsius com agitação a 300 RPM durante a noite após a incubação. Pelotize as células por centrifugação e lave suspendendo novamente em dois mililitros de PBS e pipetando suavemente com uma ponteira grande. Após a centrifugação, lave as células novamente com PBS pela segunda vez, em seguida realize uma centrifugação final e suspensão novamente em um mililitro de PBS.

Use 25 microlitros das células ressuspendidas para inocular cinco mililitros de meio mínimo. Incube as células a 37 graus Celsius com agitação durante 15 horas. Transfira 200 microlitros de cada amostra para uma placa de 96 poços e realize a leitura de OD 5 9 5 utilizando o leitor de placas.

Repita este processo a cada duas horas até 25 horas. A propensão total à ligação de domínios transmembrana individuais do proteína integral de membrana com múltiplos segmentos, a proteína de membrana latente um, foi analisada utilizando o ensaio de repórter transcricional tox R. O domínio transmembrana cinco exibe uma forte propensão à dimerização, demonstrada por altas unidades de Miller, o que é comparável ao controle positivo GPA, uma sequência dimerizante bem estabelecida.

Uma mutação prejudicial no domínio transmembrana cinco D um 50 A reduz a capacidade da sequência de ligar totalmente ao LMP um; o TM um não liga significativamente e exibe um sinal muito baixo em unidades Miller, apenas acima do sinal do branco, que corresponde a células FHK 12 não transformadas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar se uma hélice transmembrana de interesse possui a capacidade de formar complexos de ordem superior em um ambiente de membrana natural. Ao realizar este procedimento, é importante pipetar com extrema cautela na placa de 96 poços para evitar grandes erros e garantir que nenhuma bolha de ar seja introduzida.