Protocolo otimizado para transfecção eficiente de células dendríticas, sem maturação das células

O objetivo geral deste procedimento é silenciar a expressão gênica-alvo em DCS por meio da transfeção com RNAi. Isso é realizado primeiramente programando o efetor AM Maxin Nucleo. O segundo passo do procedimento consiste em misturar DCS e siRNA e pipetar a solução celular resultante nos módulos Nucleo QVE.

O terceiro passo do procedimento é colocar a placa na bandeja do shuttle amaxa para iniciar o processo de transfeção. O passo final do procedimento é infectar as células com o vírus para ativar a resposta ao interferon. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a redução gênica por meio de R-T-P-C-R quantitativa e Western blotting.

Essa técnica é valiosa para caracterizar vias de sinalização em células dendríticas e pode contribuir para o desenvolvimento de terapias imunológicas baseadas em células dendríticas. Para programar o nucleofactor Maxon de 96 poços para transfeção de DC, abra um novo arquivo de parâmetros. Selecione o número de poços que você utilizará para transfeção padrão, arrastando o cursor sobre o diagrama da placa de 96 poços.

Utilize no mínimo três poços para agrupar cada amostra experimental. Agora, insira o código do programa na parte um, selecione F, F e na parte dois, selecione 1 68 nos menus suspensos. Em seguida, na caixa de solução, selecione monócito humano; depois, na opção controle, selecione padrão e, em seguida, clique em aplicar.

Para incluir um controle sem transfeção, é necessário selecionar poços adicionais no diagrama. Em seguida, na opção de controle, escolha o controle sem programa e clique em aplicar novamente. Após misturar a solução de nucleofecção, deixe-a aquecer até a temperatura ambiente.

Coloque o número necessário de módulos nucleo vete na placa nucleo VETE na orientação correta, conforme mostrado aqui, inserindo o primeiro nos orifícios um e dois e, em seguida, assim sucessivamente para todos os tubos seguintes. Transfira quantidade suficiente de DCS de um frasco de cultura celular para um tubo de 50 mililitros para obter 500.000 células por poço para a transfeção; centrifugue as células por 10 minutos a 400 G a quatro graus Celsius e, em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, adicione a solução de nucleofecção ao tubo e, então, ressuspenda as DCS pipetando suavemente para cima e para baixo algumas vezes.

Agora rotule os tubos Eppendorf de acordo com o tratamento específico a ser realizado e, em seguida, divida as células re-suspensas nos tubos rotulados. Adicione o siRNA numa concentração final de 0,25 microgramas por 500.000 células aos tubos Eppendorf apropriados e, em seguida, homogeneíze as suspensões celulares por pipetagem. Utilize siRNA não direcionado para a amostra controle sem transfeção.

Em seguida, pipete 20 microlitros da suspensão de células SI RA DC nos módulos nucleo vete de acordo com o layout experimental previamente programado, garantindo que o líquido seja depositado no fundo do poço. Cubra a placa nucleo vete com uma tampa e bata levemente com a placa sobre uma superfície dura algumas vezes para facilitar a remoção de bolhas de ar para transfectar as DCs. Insira a placa nucleo Yvette preparada na bandeja shuttle de 96 poços do nucleo effector. Em seguida, clique no botão carregar e iniciar.

Acompanhe o progresso do processo de transfeção no visor. Uma cruz preta sobre fundo verde indica uma transfeção bem-sucedida naquela poça, enquanto uma barra preta sobre fundo vermelho indica falha durante a transfeção das células. Ao término do processo de transfeção, aqueça previamente o meio de crescimento para DC, remova a placa e adicione 80 microlitros do meio de crescimento para DC previamente aquecido a cada poça.

Usando uma pipeta multicanal, incubar agora a placa por 10 minutos a 37 graus Celsius e 5%CO2. Durante o período de incubação, adicionar 100 microlitros do meio de crescimento DC pré-aquecido aos tubos de matriz na mesma orientação do arranjo da placa de cubetas nucleo. Após o período de incubação, transferir todos os 100 microlitros das suspensões celulares das cubetas nucleo CVEs para os tubos de matriz previamente organizados.

Em seguida, remova e descarte os tubos nos quais a transfeção não ocorreu. Por fim, incube os tubos de matriz por 24 horas ou outro intervalo de tempo desejado. Rotule os tubos einor para cada um dos tubos de matriz em incubação.

Em seguida, transfira os tubos de matriz do incubador para uma capela de cultura celular e reúna os tubos de matriz de cada amostra experimental em tubos eppendorf pré-rotulados. Depois, faça um pellet suavemente das células centrifugando os tubos eppendorf em uma centrífuga de bancada durante 10 minutos a 400 ×g. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em meio de crescimento sem soro contendo o vírus da doença de Newcastle ou NDV, com uma MOI de um, de forma branda.

Cubra os epi-endorfinas de maneira estéril e, em seguida, incube os tubos por 45 minutos. Após este período de incubação, adicione 900 microlitros de meio de crescimento DC e reincube os tubos por mais oito a dez horas. Para colher as DCs transfectadas e infectadas.

Pelote as células centrifugando os tubos einor em uma centrífuga de bancada como antes e remova o sobrenadante. Monócitos dcs foram transfectados com RNAi direcionado ao RIG I ou com RNAi não específico e infectados com NDV, conforme indicado por um sinal de adição, ou mantidos não infectados, conforme indicado por um sinal de subtração, conforme detectado por R-T-P-C-R-A quantitativa. Foi observada uma redução de 75% no nível transcricional do RGA. Foi observada uma redução semelhante na expressão da interferona beta, um efetor downstream do RGA na cascata de sinalização da interferona. Além disso, a expressão de interferona beta em células controle não infectadas e transfectadas não foi detectável.

Enquanto que a resposta gênica mediada por MXA e o interferon beta foi mínima. Aqui, são apresentados os dados de uma segunda transfeção de DCS com RNAi direcionado ao RIG-I, realizada conforme a figura anterior. No entanto, todas as células foram infectadas com NDV e um controle adicional, utilizando DCS de monócitos não diferenciados, foi incluído.

Os resultados de silenciamento gênico foram semelhantes aos observados na figura anterior. Um blot ocidental com sonda para RGA revelou que a expressão proteica desse gene havia sido completamente bloqueada. As pistas um e dois mostram dados de lisados de células não ressecadas.

As pistas três e quatro mostram lisados de células transfectadas com glow irna e as pistas cinco e seis mostram lisados de células transfectadas com S irna direcionado ao RIG I. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma hora, incluindo o silenciamento de muitos genes simultaneamente.