Determinação de estruturas moleculares de glicoproteínas do envelope HIV usando Cryo-Electron Tomografia e Média Sub-tomogram Automated

Mais de 60 milhões de indivíduos foram infectados pelo HIV, o vírus que causa a aids. A aids por HIV é uma crise de saúde global, e embora esforços intensivos de pesquisa tenham prolongado drasticamente a vida de indivíduos infectados, uma vacina eficaz ainda permanece inatingível. Um foco principal da pesquisa de vacinas contra o HIV é a glicoproteína do envelope, que o HIV utiliza para entrar nas células-alvo.

Neste vídeo, demonstramos como obtemos estruturas dessa proteína importante utilizando uma técnica de imagem chamada tomografia eletrônica criogênica. A partir do HIV purificado, mostramos os passos no preparo de espécimes congelados, os passos na obtenção de imagens microscópicas eletrônicas desses espécimes congelados e os passos na conversão dessas imagens em modelos estruturais que poderiam ser úteis para o desenvolvimento de vacinas contra a aids por HIV. Um aspecto singular do que apresentamos neste vídeo é que o trabalho será demonstrado por membros de seu laboratório abrangendo uma ampla faixa etária, desde estudantes do ensino fundamental e médio até estudantes universitários e de pós-graduação, chegando a pesquisadores pós-doutorandos e cientistas seniores.

A preparação de amostras de vírus vitrificadas adequadas para tomografia eletrônica criogênica é realizada espalhando uma suspensão aquosa de vírus sobre pequenos orifícios em uma película de carbono suportada por uma grade de cobre e, em seguida, congelando rapidamente os vírus. O objetivo desta etapa é preparar um espécime congelado de vírus intactos capturados em um estado próximo ao nativo. Para começar, as grades são colocadas dentro de uma unidade de descarga por efeito corona.

Este dispositivo limpa as grades expondo-as a um gás ionizado. Agora que as grades estão prontas para uso, é preparada uma suspensão de vírus misturada com pequenas partículas de ouro. Essas partículas são essenciais para a coleta e o processamento de dados.

Em seguida, uma gota de suspensão viral é colocada sobre a grade recém-limpa com plasma. A grade é então carregada em um robô, que a seca com papel de filtro, reduzindo a gota a uma fina película de líquido. A amostra é então mergulhada em etano líquido, que congela rapidamente os vírus a uma taxa superior a 100.000 kelvin por segundo.

A grade submetida à congelação por imersão é então transferida para uma caixa de armazenamento para transporte ao microscópio. Isso é repetido até que o número desejado de grades seja congelado. Agora que as grades com a amostra do vírus estão prontas, o próximo passo é carregá-las no microscópio.

Para a obtenção de imagens, isso pode ser feito manualmente ou com assistência robótica. Quando as grades de amostra são carregadas manualmente, o usuário senta-se em uma estação especializada onde as amostras podem ser manipuladas sob nitrogênio líquido; as amostras são colocadas em uma câmara portátil resfriada a nitrogênio, que é selada, evacuada e, em seguida, acoplada ao microscópio. Microscópios mais recentes são capazes de carregamento automatizado de amostras.

Aqui, em um microscópio Titan Cryos, amostras congeladas são entregues ao microscópio pelo usuário e então carregadas roboticamente com as grades de amostra inseridas no microscópio. Cada grade pode ser examinada pelo usuário antes do início da obtenção de imagens. Os parâmetros do microscópio são configurados para cada área da grade de amostra que apresenta características de interesse.

Neste caso, as características são vírus HIV. Conforme cada nova área é definida, o computador do microscópio armazena os parâmetros de imagem específicos da área. Quando o usuário definiu todas as posições de interesse, o computador revisita automaticamente cada posição e coleta um conjunto de dados.

Cada conjunto de dados é coletado inclinando a grade da amostra em relação ao feixe de elétrons, garantindo ao mesmo tempo que o feixe permaneça focado no mesmo ponto da grade. A aquisição de dados em microscopia eletrônica tradicionalmente exigia que os usuários ficassem no microscópio e interagissem fisicamente com o equipamento. Esse estilo de interação com o microscópio é mostrado aqui durante uma visita do presidente Obama a uma fábrica da Intel.

Avanços recentes nas interfaces computacionais de microscópios permitem agora aos usuários monitorar e ajustar a coleta de dados em tempo real a partir de um computador remoto no laboratório ou em outro local. Para visualizar as formas do envelope e das espículas de glicoproteínas, as informações de centenas de imagens individuais devem ser médias para aumentar o sinal. Este é um processo intensivo em computação, que é realizado aqui por meio de um agrupamento de computadores chamado Bio Wolf.

Situado no NIH, foram desenvolvidos métodos poderosos para extrair volumes individuais e médias das informações usando algoritmos capazes de funcionar em altos níveis de ruído. Inerentes a esse tipo de dado, os mapas de densidade obtidos tanto de vírus nativos quanto de vírus em complexo com moléculas biologicamente importantes fornecem uma rica base de dados sobre a biologia estrutural do HIV. Os mapas de densidade ganham vida em detalhe molecular quando os dados são combinados com informações provenientes da cristalografia de raios X das subunidades individuais que compõem o pico da glicoproteína do envelope.

Os dados provenientes desses tomos podem ser muito densos e difíceis de interpretar. Softwares 3D da indústria de entretenimento podem ser utilizados para visualizar os modelos tridimensionais adicionando cores, texturas e iluminação, tornando-os mais fáceis de analisar. Os softwares de visualização comumente utilizados incluem o Mirror 3D Studio Max e o Maya.

Acabamos de demonstrar procedimentos passo a passo sobre como se pode obter modelos moleculares para a estrutura da glicoproteína do envelope, a partir do HIV purificado. Utilizando este método, também determinamos estruturas da glicoproteína do envelope em complexo com diversas moléculas que podem se ligar ao vírus e ser utilizadas por ele.

Aqui apresentamos um exemplo da estrutura da glicoproteína do envelope em complexo com um anticorpo chamado B12. Compreender por que algumas moléculas podem se ligar e utilizar o vírus, enquanto outras não, é muito importante para o design racional de vacinas. A determinação das estruturas moleculares das glicoproteínas do envelope do HIV ou de outros vírus, como influenza e Ebola, é fundamental para entender a entrada e a utilização virais.

Como você viu, a tomografia por criomicroscopia eletrônica está agora surgindo como uma ferramenta poderosa para alcançar esse objetivo.