Quantificar a freqüência de Tumor-propagação células usando Transplante de Células Limitando diluição em singênicos Zebrafish

O ensaio de transplante celular por diluição limite é o padrão ouro para avaliar o potencial de autorrenovação em modelos animais experimentais. Nesta demonstração, embriões de peixe-zebra alogênicos na fase de um célula são injetados com rag dois MIC e RAG dois GFP para gerar peixes-zebra transgênicos que desenvolverão leucemia linfoblástica aguda de células T marcada com fluorescência. Aos 60 dias de vida, as células leucêmicas primárias são isoladas dos peixes-zebra e posteriormente purificadas por meio de triagem celular ativada por fluorescência.

Em seguida, as células são transplantadas em diluição limite na cavidade peritoneal de peixes-zebra adultos, e os peixes são monitorados quanto ao crescimento tumoral por até 90 dias. Por fim, o programa estatístico de análise de diluição limite extrema é utilizado para quantificar a frequência de células propagadoras de leucemia dentro do tumor original. A análise de transplante de células em diluição limite permite aos pesquisadores avaliar com precisão o número de células com autorrenovação presentes na massa tumoral total.

São essas células autorrenováveis que impulsionam a formação do câncer e são, em última instância, responsáveis pela recidiva. A principal vantagem de realizar ensaios de transplante por diluição limitante no modelo de peixe-zebra é que muitos peixes podem ser transplantados em cada experimento, resultando em maior precisão ao determinar a frequência de células tumorais propagadoras com capacidade de autorrenovação. Este método fornece informações sobre as células tumorais propagadoras na leucemia linfoblástica aguda de células T.

Também pode ser aplicado para compreender outros modelos de câncer em peixe-zebra. Jessica Blackburn, pesquisadora do laboratório, e Sally Liu, uma técnica talentosa, demonstrarão o procedimento para vocês hoje. Para linearizar os plasmídeos Rag2 CM e RAG2 GFP-DNA, digira 10 microgramas de cada plasmídeo com a enzima de restrição NotI a 37 graus Celsius durante a noite. Após extração com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol, suspendemos cada plasmídeo em 20 microlitros de água.

Determine as concentrações de DNA em um gel de agarose 1% realizando uma diluição de um para um, um para cinco e um para 10 de cada plasmídeo digerido com 20 microlitros, 10 microlitros e cinco microlitros de uma escada de DNA de alto espectro. Agora, dilua o DNA até uma concentração final de 60 nanogramas por microlitro para injeção na linhagem CG um sinquênio. Injete em embriões de peixe-zebra 250 nanolitros de 30 nanogramas por microlitro de rag dois CM e 30 nanogramas por microlitro.

Injete dois GFP em embriões de peixe-zebra de um estágio celular, direcionando cuidadosamente o DNA diretamente para a célula e não para a gema. Armazene os embriões injetados a 28,5 graus Celsius e remova os embriões mortos após 24 horas; aos cinco dias de vida, transfira os animais para tanques grandes aproximadamente 28 dias após a injeção. Anestesie larvas de peixe-zebra adicionando 200 microlitros de trica S a quatro nanogramas por mililitro à água do sistema de peixes em uma placa de Petri contendo 25 mililitros.

Examine as larvas quanto ao desenvolvimento de TALL marcado com fluorescência utilizando um microscópio de epifluorescência para detectar a fluorescência de GFP. Separe as larvas positivas para tumor das negativas para garantir que nenhum peixe leucêmico seja omitido na análise. Larvas negativas podem ser examinadas em um momento posterior, uma vez que os tumores possam ter crescido mais. Monitore peixes leucêmicos marcados com fluorescência pelo menos uma vez por semana utilizando o microscópio de epifluorescência para acompanhar o crescimento do tumor.

Quando as células leucêmicas positivas para GFP tiverem invadido mais de 50% do animal, adicione um mililitro de quatro nanogramas por mililitro de Trica S em uma placa de Petri contendo nove mililitros de água de sistema para peixes para sacrificar o peixe. Coloque o peixe em uma nova placa de Petri contendo um mililitro de soro bovino fetal a 5% em PBS 0,9 X. Macere o peixe com uma lâmina de barbear e pipete a mistura para dissociar grandes agregados celulares. Em seguida, passe as células através de uma peneira de malha de 40 micrômetros para um tubo de 50 mililitros.

Pipete 500 microlitros das células para um tubo de poliestireno de quatro mililitros. Adicione um microlitro de um miligrama por mililitro de iodeto de peridina para marcar as células mortas, vortex, e mantenha as células em gelo. Prepare também um peixe selvagem CG1 para coletar células sanguíneas normais, que servirão como transportadoras para as células tumorais durante o transplante, adicionando quatro mililitros de FPS a 5% em PBS 0,9 X ao tubo de 50 mililitros, obtendo um volume total de cinco mililitros.

Conte as células sanguíneas normais diluídas até três vezes 10 à quinta células por mililitro em FBS a 5% em PBS 0,9x, em seguida, pipete 100 microlitros por poço de uma placa de 96 poços usando um classificador de células ativado por fluorescência para separar células tumorais GFP positivas e PI negativas para dentro da placa de 96 poços contendo as células sanguíneas nas doses indicadas. Adicionalmente, separe 10.000 células em um poço sem células sanguíneas normais e reanalise utilizando citometria de fluxo para avaliar a pureza e viabilidade das células separadas. Centrifugue a placa de 96 poços a 2000 ×g por 10 minutos para sedimentar as células.

Remova 95 microlitros do sobrenadante e ressuspenda as células nos cinco microlitros restantes. Injete a suspensão celular na cavidade peritoneal de peixes-zebra alogênicos com mais de 60 dias de idade utilizando uma microseringa de calibre 26 e meio. Os peixes-zebra não precisam ser anestesiados antes do transplante.

Transplante 45 peixes com 10 células leucêmicas, 20 peixes com 100 células, sete peixes com 1000 células e cinco peixes com 10.000 células TALL aproximadamente 28 dias após o transplante. Examine os peixes-zebra receptores com um microscópio de fluorescência epifluorescente utilizando um comprimento de onda de excitação de 485/20 e um filtro de emissão de 530/25 para detectar a fluorescência GFP.

Registre o número de peixes positivos por número total de peixes injetados. Reexamine os peixes a cada 14 dias, por até 90 dias, e registre o número de peixes positivos. Quando um peixe com tumor positivo se tornar mais abundante.

Sacrifique o animal por sobredosagem de trica US, insira os resultados em uma tabela e envie os dados para o software baseado na web de análise de diluição limitante extrema para determinar a frequência de células leucêmicas com autorrenovação dentro dos embriões primários TALL CG. Um linhagem foi injetada com RAG dois cmic e larvas RAG dois GFP foram selecionadas para TALL primário. Após 28 dias, de acordo com trabalhos anteriores, aproximadamente 5% dos peixes injetados apresentam linfócitos T GFP positivos em seu timo, e 100% desses peixes desenvolverão leucemia. Aqui, células TALL marcadas com fluorescência foram separadas de animais doentes com 65 dias de idade e utilizadas no ensaio de transplante celular por diluição limitante. Primeiro, um portão foi desenhado para selecionar células individuais.

Em seguida, foram selecionadas as células negativas para iodeto de propídio. E, finalmente, foi traçado um porte para selecionar apenas as células leucêmicas positivas para GFP a serem separadas. Neste exemplo de peixes transplantados com TALL no dia 28, tumores em estágio inicial foram observados como uma área de células positivas para GFP próxima ao local da injeção.

Embora alguns TLS estivessem mais avançados, tendo se expandido para preencher a cavidade peritoneal para esses experimentos, mais de 220 animais foram transplantados, o que pode ser facilmente realizado por uma única pessoa em algumas horas. A análise de dados utilizando o software elda mostrou que, em média, uma em cada 135 células T era uma célula propagadora de leucemia com capacidade de autorrenovação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como transplantar células tumorais em diluição limitante na cavidade peritoneal de peixes-zebra alogênicos e de como utilizar os dados resultantes para determinar a frequência de células propagadoras de tumor dentro de um tumor específico.

Estudos adicionais que utilizem animais geneticamente modificados podem ajudar a identificar os mecanismos que regulam a autorrenovação dessas células propagadoras de tumores.