Análise mosaico de função do gene em desenvolvimento pós-natal do rato do cérebro usando Virus baseado Recombinação Cre
1 de agosto de 2011
Um In vivo Método para testar a função do gene no cérebro pós-natal é descrito. AAVs recombinante expressando Cre e / ou uma proteína fluorescente são injetadas no cérebro de rato neonatal. Inativação do gene mosaico e rotulagem neuronal esparsos são alcançados, permitindo a análise rápida da função dos genes em processos críticos para o desenvolvimento do circuito neural.
O objetivo geral deste procedimento é manipular a função gênica durante o período pós-natal do desenvolvimento cerebral. Isso é realizado primeiramente pela seleção e preparação dos vírus apropriados, carregando-os na seringa e preparando o equipamento de injeção. Em seguida, o vírus é injetado nos cérebros de filhotes recém-nascidos de camundongo, e o passo final consiste em sacrificar os animais e obter imagens das regiões injetadas.
No final, podem ser obtidos resultados que mostram marcação diferencial de células controle e células knockout por meio de microscopia de imunofluorescência. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da neurociência, como a forma como o período de desenvolvimento pós-natal é geneticamente regulado. Para injeção, pode-se usar uma solução comercialmente disponível de vírus adeno-associado em título completo, tipicamente 10 à 12ª potência, cópias genômicas por mililitro, para manipular um grande número de células.
Se uma diluição escassa ou rotulagem for desejada, inicie com uma diluição de um para dez. Após descongelar o vírus em gelo, transfira imediatamente o volume da pré-diluição para um tubo estéril de PCR de 250 microlitros. Mantenha a diluição em gelo. Agora.
Prepare a bomba de injeção selecionando uma seringa apropriada e conectando-a a uma agulha de carga. Em seguida, aspire suavemente a solução viral até que uma bolha de ar muito pequena seja visível na seringa, podendo-se usar um corante inerte de carga para facilitar este passo. Agora, fixe a seringa à bomba com um suporte.
Em seguida, acople suavemente a tubulação de conexão entre a seringa e o suporte da agulha. Certifique-se de que a agulha de injeção esteja em contato direto com a tubulação de conexão no interior do suporte da agulha. Agora, mova lentamente a solução através da tubulação de conexão até que uma pequena gota da solução seja visível na ponta da agulha.
Fixe cuidadosamente o êmbolo ao lado do bloco empurrador com um suporte na bomba. Ajuste a taxa de injeção para oito microlitros por minuto e defina o volume de injeção entre um e dois microlitros. Em seguida, ajuste o diâmetro da seringa na configuração da bomba para corresponder ao diâmetro da seringa que está sendo utilizada.
Por fim, para proteger os filhotes durante a fase de recuperação, ajuste a placa aquecida a 38 graus Celsius e cubra-a com uma toalha de papel. Utilizando um protocolo aprovado pelo IACUC, prepare filhotes de camundongo P zero ou P um para injeção submetendo-os à anestesia por frio. Umedeça algumas toalhas de papel com água e coloque-as sobre gelo.
Em seguida, coloque quatro ou cinco filhotes sobre o papel-toalha bem separados. Dobre suavemente o papel-toalha sobre os filhotes, coloque uma pequena quantidade de gelo triturado por cima do papel-toalha e incube os filhotes por cerca de cinco minutos. Os filhotes podem ser mantidos com segurança sobre gelo por até 15 minutos e ainda apresentar uma boa recuperação.
Agora posicione uma cria anestesiada sobre um bloco de montagem para obter o melhor acesso ao local da injeção. Por exemplo, o córtex é mais facilmente acessado colocando o animal deitado em decúbito ventral. A cria pode ser fixada no lugar usando um curativo adesivo, estabilizando manualmente a cabeça da cria e puxando a pele para mantê-la firme e evitar movimentos.
Em seguida, localize os marcos anatômicos do crânio, como a sutura lambda, e selecione com a outra mão um ponto de injeção reprodutível; insira suavemente a agulha através do crânio. Não aplique muita força se a agulha não penetrar facilmente no crânio. Em vez disso, reposicione a agulha e tente novamente com delicadeza.
A profundidade de injeção varia ligeiramente entre animais e cepas individuais para o córtex; geralmente, uma profundidade entre meio a um milímetro é adequada. Agora, injete a solução viral fazendo com que um colega ative a bomba para minimizar movimentos manuais. Idealmente, um pedal de ativação poderia ser usado para ligar a bomba após a injeção.
Mantenha a agulha no lugar por alguns segundos, depois, mantendo a cabeça da cria imóvel, retire-a suavemente. Agora, permita que a cria se recupere por cinco a dez minutos sobre a placa aquecida coberta.
Durante esse período, continue injetando as outras crias. Quando todas as crias tiverem recuperado a cor rosada e estiverem se movimentando, massageie-as suavemente com uma parte da camação de sua casa. Somente então elas podem ser devolvidas à mãe.
Caso contrário, eles podem ser tratados como filhotes desconhecidos, o que provavelmente levará a mãe a matá-los após o retorno dos filhotes a ela. Limpe o conjunto de injeção carregando completamente a seringa com acetona ou etanol 70%. Se houver componentes sensíveis à acetona, como sano, acurate ou adesivos, enxágue a solução pelo conjunto de injeção várias vezes, utilizando solução fresca a cada vez.
Isso removerá qualquer solução remanescente de vírus e fará com que os solventes evaporem. Após a lavagem do equipamento, desinfete a área de trabalho com hipoclorito para deixá-la pronta para o próximo pesquisador. Mentor. A técnica bem-sucedida produz uma infecção neuronal robusta no local da injeção.
Injeções em regiões específicas, como o córtex e o colículo superior, geralmente geram infecções locais com disseminação mínima para regiões adjacentes. O uso de uma solução viral com título elevado torna mais provável a infecção de áreas adjacentes, como o hipocampo, em comparação com a injeção de uma solução viral com título baixo, que resulta em infecção esparsa, tipicamente próxima ao local da injeção. Por exemplo, na injeção cerebelar na linha média, o número de células infectadas deve correlacionar-se com o título da solução viral injetada.
Por exemplo, injetar uma mistura de soluções com título elevado de dois vírus R AAV oito que expressam proteínas fluorescentes diferentes no cerebelo infecta muitas células kinji que são marcadas de forma diferencial. Inversamente, injetar uma solução viral com título baixo pode resultar em infecção esparsa, o que auxilia na visualização de células individuais. Neurônios marcados com fluorescência podem ser observados diretamente em tecido vivo recém-seccionado ou podem ser submetidos a imunomarcação.
Isso potencializa os sinais fluorescentes endógenos para a aquisição posterior de imagens por microscopia fluorescente de campo amplo ou confocal. Por fim, o RAAV oito é capaz de infectar uma variedade de tipos neuronais na córtex com marcação intensa de processos finos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente 30 minutos, se executada corretamente.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método in vivo para testar a função gênica durante o desenvolvimento cerebral pós-natal utilizando AAVs recombinantes. Ao injetar esses vírus nos cérebros de camundongos neonatos, os pesquisadores podem obter inativação gênica em mosaico e marcação esparsa de neurônios, facilitando a análise da função gênica no desenvolvimento de circuitos neurais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Função Gênica
- Desenvolvimento de Circuitos Neurais
Antecedentes
- Compreender a função dos genes durante o desenvolvimento cerebral pós-natal é fundamental.
- Os vírus adeno-associados recombinantes podem ser utilizados para manipular a expressão gênica.
- Este método permite o estudo da regulação genética durante períodos críticos de desenvolvimento.
- A microscopia de imunofluorescência pode diferenciar entre células controle e células com genes inativados.
Objetivo do Estudo
- Manipular a função gênica no período pós-natal do desenvolvimento cerebral.
- Investigar como fatores genéticos regulam o desenvolvimento neural pós-natal.
- Fornecer insights sobre os mecanismos subjacentes à formação de circuitos neurais.
Métodos Utilizados
- Seleção e preparação de AAVs recombinantes apropriados.
- Injeção de vírus nos cérebros de filhotes de camundongos recém-nascidos.
- Microscopia de imunofluorescência para imagem das regiões injetadas.
- Análise da marcação diferencial de células controle e células knockout.
Resultados Principais
- Inativação gênica e marcação neuronal bem-sucedidas alcançadas.
- Os resultados demonstram a regulação genética do desenvolvimento pós-natal.
- O método fornece uma estrutura para pesquisas futuras em neurociência.
- Os conhecimentos obtidos podem contribuir para a compreensão da dinâmica dos circuitos neurais.
Conclusões
- Este método é eficaz para estudar a função gênica no cérebro em desenvolvimento.
- Os achados contribuem para a compreensão do desenvolvimento dos circuitos neurais.
- Pesquisas futuras podem se basear nesta abordagem para explorar as influências genéticas no comportamento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite uma investigação rápida e escalonável da função gênica no desenvolvimento cerebral pós-natal, abordando uma lacuna crítica na validação de alvos para transtornos neurodesenvolvimentais. Ao contornar as limitações da letalidade embrionária, ele possibilita a redução de riscos mecanicistas de alvos terapêuticos em vias relevantes para o autismo e a esquizofrenia. A abordagem oferece confiança preditiva na seleção de alvos ao associar perturbações genéticas a fenótipos em nível de circuito em um sistema fisiologicamente relevante.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da função gênica em circuitos neurais pós-natais, onde muitos genes associados a transtornos neurodesenvolvimentais exercem seus efeitos.
- Valor Operacional: Permite a inativação gênica em mosaico e a marcação esparsa em poucos dias, evitando a geração de modelos de camundongos condicionais que leva meses.
- Valor Científico: Possibilita a análise funcional autônoma celular de genes implicados no crescimento axonal, no emplacamento dendrítico e no refinamento de sinapses.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor científico: Gera populações de controle e com genes eliminados quantitativamente comparáveis por meio de marcação fluorescente diferencial para avaliação fenotípica paralela.
- Valor operacional: Permite a titulação do título viral para modular a densidade de infecção, possibilitando marcação esparsa ou densa em escala conforme necessário para ensaios posteriores.
- Valor científico: Compatível com leituras de imunofluorescência e eletrofisiologia, facilitando a validação multimodal do engajamento do alvo e do impacto no circuito.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Valor Científico: Modela perturbações genéticas pós-natais em camundongos e ratos, alinhando-se ao período de desenvolvimento correspondente ao início dos transtornos neuropsiquiátricos humanos.
- Valor Operacional: Estende-se à entrega por lentivírus e a construtos de shRNA ou dominantes negativos, ampliando a ferramenta de modulação de alvos para validação pré-clínica.
- Valor Científico: Permite o estudo da função gênica em processos críticos como a formação de sinapses, diretamente relacionados aos mecanismos fisiopatológicos dos transtornos psiquiátricos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial, apoiando a validação de alvos e a identificação de compostos ativos ao fornecer evidências genéticas causais em circuitos neurais pós-natais antes da triagem de compostos.
- Biologia de Descoberta: Testa hipóteses terapêuticas por meio da deleção de genes candidatos em regiões cerebrais definidas para avaliar as consequências fenotípicas na maturação do circuito neural.
- Triagem: Produz preparações neuronais padronizadas e reprodutíveis com controles internos (células marcadas versus não marcadas) para medição confiável dos efeitos de compostos.
- Análise: Gera leituras quantitativas de imagem e eletrofisiológicas que permitem comparação estatística entre genótipos e condições de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Conecta a manipulação genética a resultados em nível de circuito, apoiando a validação pré-clínica alinhada a biomarcadores da modulação de alvos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável de entrega viral aplicável a múltiplos alvos genéticos e regiões cerebrais, reduzindo o desenvolvimento redundante de modelos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos ao associar a perda gênica pós-natal a fenótipos específicos de circuito.
- Valor Operacional: Padroniza a perturbação gênica por meio de entrega viral, melhorando a reprodutibilidade entre laboratórios e estudos.
- Valor Estratégico: Acelera decisões de avanço ou interrupção do projeto ao estabelecer rapidamente a causalidade genética em janelas pós-natais relevantes para doenças.
- Impacto no Portfólio: Reduz os riscos no avanço de alvos ao fornecer evidências funcionais em sistemas que modelam o cronograma do neurodesenvolvimento humano.
Considerações de Implementação
- Exige experiência no manejo de camundongos neonatos, injeção estereotáxica e protocolos de biossegurança viral.
- Depende do acesso a vetores virais recombinantes purificados, como AAV ou lentivírus, e à infraestrutura de microscopia de fluorescência.
- Necessita padronização da titulação viral, volume de injeção e procedimentos de anestesia para garantir consistência entre estudos.
- A adaptação a diferentes regiões cerebrais ou espécies pode exigir otimização das coordenadas de injeção e do tropismo do sorotipo viral.
- Limitação prática: a eficácia depende da eficiência da recombinase Cre e da disponibilidade de alelos flanqueados por loxP (floxed), que podem variar conforme o alvo.
