Método de aglutinação de partículas de Identificação Poliovirus

O objetivo geral do procedimento a seguir é identificar rapidamente isolados do vírus da poliomielite utilizando um protocolo simples. Para este ensaio, utilizamos partículas de gelatina sensibilizadas revestidas com moléculas quiméricas contendo o domínio extracelular do receptor humano do vírus da poliomielite ligado ao fc da IgG2. Como essas partículas possuem afinidade uniforme por todos os sorotipos de isolados do vírus da poliomielite, ocorre aglutinação das partículas após incubação com amostras contendo qualquer vírus da poliomielite humano.

No entanto, se estiverem presentes anticorpos capazes de reconhecer o isolado viral específico da amostra, ocorre neutralização e impede-se a aglutinação; utilizando este sistema experimental, a identificação rápida de isolados de poliovírus pode ser realizada em uma única etapa reacional. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o teste convencional de neutralização, é a simplicidade da SIM no procedimento e na interpretação, com o objetivo de reduzir a mão de obra necessária e acelerar o tempo para obtenção dos resultados. Para reconstituir os anticorpos anti PV um, PV dois e PV três, adicione 0,5 mililitros de água a cada frasco.

Em seguida, transfira cada solução de anticorpo para tubos separados contendo 4,5 mililitros de meio de manutenção. Alguns lotes do anticorpo anti-PV são fornecidos na forma reconstituída; para esses lotes de anticorpo anti-PV, a adição de água para reconstituição não é necessária.

Em seguida, prepare misturas um para um da solução combinada de anticorpos com um volume final de 3,6 mililitros em tubos novos e rotulados. Por exemplo, misture 1,8 mililitro de anti PV um com 1,8 mililitro de anti PV dois. Para preparar uma combinação de anti PV um mais PV dois, repita isso para todas as combinações possíveis aos pares e também prepare uma solução contendo os três tipos de anticorpos, misturando 1,2 mililitro de cada antissoro.

Uma vez que as quatro misturas tenham sido preparadas, adicione 720 microlitros de SBF a cada solução de anticorpo. Isso ajudará a reduzir a aglutinação não específica de partículas de gelatina por anticorpos durante o ensaio. Os pools de anticorpos podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius até serem utilizados no ensaio de aglutinação.

Neste ensaio, utilizamos partículas de gelatina liofilizadas que foram revestidas com os domínios extracelulares do receptor humano do poliovírus e da IgG dois domínios FC de camundongo. Certifique-se de usar um único lote de partículas e não lotes diferentes em um mesmo experimento para garantir a consistência da imagem de aglutinação; reconstitua as partículas com 1,5 mililitros de tampão de reconstituição por frasco. Agite suavemente para misturar bem.

As partículas reconstituídas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por até duas semanas. Primeiro, planeje seu experimento em uma placa de microtitulação de 96 poços. Para cada amostra, o poço número um conterá apenas o vírus.

Os poços de dois a cinco conterão o vírus mais uma das quatro soluções de anticorpos mistos. Certifique-se de reservar um poço para um controle negativo contendo apenas meio de cultura, sem vírus ou anticorpo. Após montar a placa, adicione 12 microlitros da solução de anticorpo correta a cada poço das linhas dois a cinco e 12 microlitros de meio de crescimento.

Meio ao vírus isolado, poços na linha um e ao poço de controle negativo na linha seis. Em seguida, adicione 12 microlitros de amostra de vírus nas cinco primeiras linhas e 12 microlitros de meio de crescimento ao poço de controle negativo na linha seis. Após o plaqueamento dos anticorpos e do vírus, ressuspenda, suspenda os partículas de gelatina reconstituídas batendo suavemente e adicione imediatamente 25 microlitros de partículas por poço a todos os poços.

É importante não deixar que as partículas sedimentem antes de transferi-las para a placa, a fim de obter quantidades iguais de partículas em cada poço. Coloque a placa do ensaio em um agitador de placas e agite por 30 segundos. Em seguida, coloque a placa sobre uma folha de papel branco e incube-a em temperatura ambiente por duas horas para permitir a ocorrência de aglutinação.

É importante não mover a placa em momento algum durante ou após a incubação, pois a aglutinação formada é instável. Após a ocorrência da reação, tire várias fotos da placa nas quais a qualidade da aglutinação em cada poço possa ser avaliada. Em poços onde a aglutinação não ocorreu, como mostrado aqui à esquerda, as partículas coloridas de gelatina precipitarão no fundo do poço; já nos poços onde a aglutinação ocorreu, isso não acontecerá.

Devido à interação entre o vírus e as partículas de gelatina revestidas com IgG duas A, um padrão difuso colorido é visível, conforme mostrado no centro. Neste experimento, testamos a capacidade das soluções de vírus, PV um, dois e três, de induzir glu na presença do anticorpo. Conforme indicado aqui, nas combinações na ausência de vírus ou anticorpos, nenhuma aglutinação ocorre e as partículas de gelatina precipitam; em contraste, no poço contendo vírus, mas sem anticorpos.

A aglutinação ocorreu devido à interação do vírus. Com as partículas de gelatina revestidas com IgG do PVR no experimento, a aglutinação dos vírus é impedida em qualquer poço que contenha anticorpos que neutralizem especificamente esse vírus. Por exemplo, a aglutinação do poliovírus do tipo um é impedida em poços contendo anticorpos anti-PV um, mas não em poços contendo apenas anticorpos anti-PV dois e anti-PV três.

O mesmo é válido para os tipos dois e três do poliovírus. Embora seja um procedimento mestre, esta técnica pode ser realizada em apenas três horas, se for executada corretamente.