Purificação de preparação, e Caracterização de Complexos de lantanídeos para uso como agentes de contraste para Imagem por Ressonância Magnética

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar, purificar e caracterizar complexos contendo lantanídeos que possam ser utilizados para marcar macromoléculas biológicas. Isso é realizado primeiramente misturando o material metálico inicial e o ligante, controlando ao mesmo tempo o pH da solução. O segundo passo do procedimento consiste em purificar o complexo resultante utilizando diálise.

Em seguida, é necessário verificar a ausência de metal livre. O passo final do procedimento é a caracterização das propriedades do complexo relevantes para a imagem. Por fim, podem ser obtidos resultados que demonstram que os complexos sintetizados atuarão como agentes de contraste por meio de medições de atividade de relaxação.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de imagem, como se o número de coordenação da água de um agente de contraste muda ao se ligar a uma proteína. Geralmente, indivíduos que necessitam deste método enfrentarão dificuldades, pois não controlar cuidadosamente o pH tornará o LI inútil para a educação em biociências. A demonstração das medidas de diálise e atividade será realizada por Buda e Sashi.

Estudantes de pós-graduação do meu laboratório: para iniciar a metalação utilizando sais de lantanídeo, primeiro dissolva uma equivalência de ligante em água para produzir uma solução entre 30 e 265 milimolares. O ligante Paraiso Benzyl DTPA é usado aqui numa concentração de 73 milimolares. Em seguida, ajuste o pH da solução do ligante entre 5,5 e sete adicionando hidróxido de amônio 1 molar.

Neste vídeo, 0,2 mililitros da solução um molar de hidróxido de amônio são usados para dissolver de um a duas equivalentes de cloreto de lantanídeo em água, produzindo uma solução com concentração de cinco a 1000 milimolares. Pode-se usar cloreto de európio ou cloreto de gadolínio em concentrações de 111 milimolares. Frequentemente, utiliza-se um excesso de metal para levar a reação à conclusão e, consequentemente, simplificar a purificação.

Em seguida, adicione cada solução de sais de lantânio à solução preparada do ligante sob agitação. Ajuste agora o pH das misturas reacionais resultantes entre 5,5 e sete mediante a adição de hidróxido de amônio 0,2 molar. Aqui, um volume total de 0,5 mililitro da solução de hidróxido de amônio 0,2 molar é utilizado para ajustar a solução.

Se o ligante utilizado contiver grupos funcionais sensíveis a ácido, ajuste o pH várias vezes durante esta etapa. Tenha cuidado ao ajustar o pH, pois se a solução tornar-se muito básica, quaisquer grupos funcionais sensíveis à base, como isotiocianato, tornar-se-ão inutilizáveis. Para a conjugação, monitore atentamente a reação por meio de medições de pH.

A reação está completa quando o pH permanece constante. Para ligantes sem grupos funcionais sensíveis à base, um tratamento que envolva o aumento do pH também pode ser útil. Para iniciar o tratamento por diálise, determine um comprimento apropriado de tubo de diálise para conter o volume da amostra mais um comprimento adicional para acomodar 10% a mais do volume da amostra. Em seguida, siga as orientações do fabricante para cortar o tubo nesse comprimento.

Neste vídeo, foi utilizada uma membrana com corte de peso molecular de 100 a 500 Daltons, mas pode-se usar tubos com corte de peso molecular maior, conforme apropriado, se a conjugação for realizada antes da metilação, se adequado. Com base nas orientações do fabricante, mergulhe o tubo de diálise cortado em água por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, encha um reservatório de diálise com água, que servirá como diafiltrante. Um béquer de um litro é usado aqui.

O volume do dializado deve ser aproximadamente 100 vezes maior que o do amostra. Dobre agora uma extremidade do tubo duas vezes e fixe a parte dobrada com o grampo de fechamento para diálise. Enrole a extremidade do grampo com uma borracha para garantir que permaneça fechada durante a diálise.

Filtre a mistura de reação previamente preparada através de um filtro de 0,2 mícrons. Em seguida, carregue o filtrado na extremidade aberta da tubulação, tomando cuidado para não rasgar a tubulação.

Certifique-se de deixar espaço suficiente para fechar o tubo. Dobre duas vezes a extremidade aberta restante do tubo, depois fixe-a com um fecho e enrole o fecho com um elástico. Em seguida, prenda um frasco de vidro contendo ar à pinça em uma das extremidades do tubo de diálise usando outro elástico.

Em seguida, prenda um frasco contendo areia ao outro grampo. Esses frascos garantem que o tubo permaneça imerso no dialisato. Agora, coloque o tubo inteiro no reservatório de diálise que contém o dialisato.

Agite o dializado usando uma placa de agitação magnética em velocidade baixa à temperatura ambiente. Certifique-se de que a velocidade de agitação permaneça baixa e que a solução não vorte. Troque o dializado três vezes ao longo de um dia.

Neste vídeo, o dializado é trocado às 2,5, 6,5 e 11,5 horas. Deixe a diálise prosseguir durante a noite, por um tempo total de 20 a 28 horas. Após a conclusão da diálise, remova o tubo do dializado e abra cuidadosamente um fechamento para retirar a amostra.

Lave o tubo de diálise três vezes com água e combine as lavagens com a amostra. Por fim, remova a água da amostra sob pressão reduzida aqui. Isso é realizado por liofilização.

A amostra é congelada e, em seguida, colocada em um aparelho de liofilização. Para avaliar a presença de metal livre na amostra, prepare primeiro o tampão acetato dissolvendo 1,4 mililitros de ácido acético em 400 mililitros de água, ajuste o pH para 5,8 com hidróxido de amônio 1 molar e adicione água para obter um volume total de 500 mililitros. Em seguida, dissolva 0,3 miligramas de cada complexo em 0,3 mililitros de tampão.

Agora prepare o indicador xol laranja, que deve ter concentração de 16 micromolar no tampão pH 5,8. Adicione três mililitros dessa solução indicadora aos complexos metálicos previamente dissolvidos. Detecte a presença de metal livre pela observação da mudança de cor do indicador, de amarelo para violeta.

Se desejar, a quantidade de metal livre pode ser quantificada mediante a criação de uma curva de calibração. Se restar metal livre, a amostra deve ser purificada adicionalmente utilizando diálise ou cromatografia líquida de alta eficiência antes da caracterização. Em seguida, para determinar o número de coordenação com água de uma amostra de ópio, prepare uma solução de cerca de um milimolar do complexo contendo ópio em água e, depois, outra solução da mesma concentração em óxido de deutério.

Antes da análise, a solução de óxido de deutério deve ser evaporada e dissolvida em óxido de deutério três vezes para remover a água residual, ligue o espectrofluorímetro, adicione a solução aquosa a uma cubeta limpa e coloque a cubeta no espectrofluorímetro. Em seguida, realize as excitações e emissões para determinar os máximos para cada uma em aproximadamente 395 nanômetros, 595 nanômetros, respectivamente. A seguir, realize um experimento de decaimento temporal de fosforescência utilizando os comprimentos de onda de excitação e emissão recém-determinados e os parâmetros exibidos aqui.

Repita este passo com uma solução preparada de óxido de deutério a partir dos dados de decaimento da luminescência obtidos recentemente; plote o logaritmo natural da intensidade versus tempo. Os coeficientes angulares dessas retas são as taxas de decaimento. Neste vídeo, o Microsoft Excel 2007 foi utilizado para gerar os gráficos de logaritmo natural a partir dos dados brutos.

Utilize as taxas de decaimento na equação desenvolvida por Hors e colaboradores mostrada aqui. Se o seu ligante contiver grupos OH ou NH coordenados ao metal, então a equação deve ser modificada antes do uso. Para determinar as medidas de relaxividade da amostra, primeiro selecione o modo de aplicação desejado no analisador de tempo de relaxação, seja T um ou T dois.

Aqui, a configuração T um é selecionada. Em seguida, prepare uma série de amostras que contenham diferentes concentrações do complexo contendo lantanídeo em um solvente apropriado. Aqui, a água é usada como solvente e soluções de dez cinco dois 0,5, 1,25, 0,625 e zero.

São preparados em milimolar. Outros solventes ou tampões podem ser usados, mas é importante utilizar o solvente como branco. O volume final da amostra é específico para o instrumento que está sendo utilizado.

Coloque uma amostra no instrumento e deixe repousar por cinco minutos para equilibrar à temperatura do instrumento, que é de 37 graus Celsius para a unidade utilizada neste vídeo. Agora, determine o tempo de relaxação em unidades de segundos ajustando os parâmetros do software para obter uma curva exponencial suave para T um ou T dois. Repita isso para todas as amostras, incluindo a amostra em branco.

Agora, calcule o inverso dos valores medidos de T um ou T dois de relaxação e faça o gráfico. Esses valores em função da concentração de Lantan, em unidades de milimolar, devem ser ajustados com uma linha reta. A inclinação da linha ajustada é a atividade de relaxação, sendo R um ou R dois para T um e T dois, respectivamente.

Aqui observamos o esquema geral para mediação e purificação. Este esquema descreve o procedimento geral para metação e os motivos para escolher diferentes rotas de purificação. Aqui vemos um gráfico representativo de decaimento da luminescência no qual o logaritmo natural do decaimento é plotado em função do tempo; os coeficientes angulares das retas obtidas a partir de curvas semelhantes para soluções aquosas e de óxido de deutério são utilizados com a equação um para determinar o número de coordenação de água em complexos contendo ópio.

Um exemplo representativo de medições de livilidade pode ser visto aqui, com a inclinação da linha ajustada correspondendo à livilidade T1 da amostra. Além do número de coordenação da água e da caracterização da livilidade descritos no protocolo, também é importante caracterizar os produtos finais utilizando técnicas químicas padrão. A identidade do composto pode ser obtida por espectrometria de massas; espectros de massa representativos, mostrando os padrões isotópicos diagnósticos para complexos contendo gadolínio e ópio, são apresentados aqui.

Após este procedimento, outros métodos como espectroscopia ENDOR, HPLC e análise elementar podem ser realizados para caracterizar mais completamente os complexos obtidos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sintetizar, purificar e caracterizar complexos contendo lantanídeos que podem ser usados para marcar macromoléculas biológicas.