Multieletrodos Recordings Array of Avalanches Neuronal em culturas organotípicas

O objetivo deste experimento é estudar a auto-organização da atividade cerebral saudável em avalanches neuronais, a característica marcante da dinâmica de estado crítico na córtex. Isso é alcançado combinando uma fatia coronal da córtex em camadas com uma fatia do mesencéfalo, que fornece entradas dopaminérgicas importantes para o desenvolvimento da córtex. Como segundo passo, o co-cultivo de córtex e mesencéfalo é cultivado em um arranjo de múltiplos eletrodos, o que permite a estimulação e gravação de atividades neuronais em múltiplos locais na cultura.

Em seguida, permitimos que a co-cultura aplaine, expanda e adere à superfície da MEA durante as primeiras uma a duas semanas em um incubador especialmente projetado, que submete a cultura a ciclos de exposição ao ar ambiente e ao meio de cultura. São obtidos resultados fluidos que mostram a auto-organização espontânea de rajadas de potenciais de campo locais espaciotemporais em avalanches neuronais. Com base em gravações da MEA e na análise offline de avalanches, que identifica a lei de potência nos tamanhos das avalanches.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como culturas dissociadas, é o seu aspecto de neurociência sistêmica. Podemos realizar cocultivos de diversas regiões cerebrais simultaneamente, e essas culturas multirregionais estabelecem uma organização cerebral correta em grandes escalas, como camadas corticais e sistemas de projeção. As aplicações desta técnica vão além do simples estudo de avalanche de neurônios.

Por exemplo, podemos estudar o estímulo em resposta no nível da rede sob condições in vitro rigorosamente controladas. A demonstração visual deste método é essencial, pois a aplicação adequada da mistura de trombina plasmática e o posicionamento do tecido na MEA são difíceis de aprender. Esses passos exigem tempo adequado, o gradiente de temperatura correto e evitar tocar diretamente a superfície delicada da MEA.

Para preparar uma câmara de vidro estéril e vedável para gravações, primeiro corte cilindros de vidro com rosca e tampa de plástico de teflon, aproximadamente dois milímetros acima da base da rosca. Eles são necessários para garantir o fechamento seguro e hermético da câmara de cultura. Em seguida, limpe os anéis de vidro enxaguando-os com água três vezes e, depois, fervendo-os por cinco minutos em álcool etílico a 200 graus.

Reserve-os para secar, pois é necessário uma solução de silicone para fixar os anéis de vidro à superfície da MEA. Utilize um kit de elastômero de silicone Cell Guard 180 4 e misture completamente 15 mililitros das partes A e B. Em seguida, deixe repousar por 15 minutos para remover as bolhas de ar.

Divida a solução em alíquotas de um mililitro no Eloqua e armazene a menos 20 graus Celsius para uso futuro. Agora, cole um anel de vidro à MEA aspirando um mililitro de silicone a 23 graus Celsius em uma seringa com agulha de pequeno calibre e aplicando-o na superfície cortada não polida do anel de vidro. Em seguida, posicione o anel de vidro centralizado sobre a MEA e aplique uma camada adicional de silicone ao redor da parte externa do anel para obter um selamento mais resistente.

Deixe curar por uma a duas horas a cerca de 60 graus Celsius em uma placa aquecedora. Em seguida, esterilize a câmara MEA e as tampas da câmara sob capela de fluxo laminar, enxaguando três vezes com água desionizada e depois três vezes com álcool 70%, sendo o último enxágue com álcool. Deixe a câmara repousar por 10 minutos no álcool.

A seguir, exponha o interior da câmara e da tampa à luz UV por 10 minutos. Autoclave a 120 graus Celsius por 45 minutos. Após a esterilização, deixe-os secar.

Agora, recubra a superfície da MEA dentro da câmara de cultura com poli-D-lisina. As MEAs novas utilizadas neste experimento são bastante lipofílicas; portanto, realize o revestimento por meio de gotas repetidas. Aspire a solução da grade de eletrodos.

Acople a tampa para selar a câmara de MEA para armazenamento e uso futuro. Este procedimento fornece seções do córtex e da VTA para cerca de 12 culturas co-cultivadas e deve ser realizado dentro de uma câmara de fluxo laminar em condições estéreis, utilizando animais saudáveis com um a dois dias de vida pós-natal; o tempo total para a coleta de tecido deve ser inferior a uma hora. Após a decapitação, inicie a remoção do cérebro fazendo primeiro dois cortes laterais com tesoura para retirar a pele do couro cabeludo.

Remova e corte o crânio com uma tesoura fina para olhos, fazendo um corte sagital mediano e um corte coronal na junção entre o córtex e o cerebelo. Vire para trás os quatro retalhos ósseos para expor o cérebro. Em seguida, com uma espátula afiada, corte frontalmente através do bulbo olfatório.

Em seguida, avance a espátula em quartos sob o cérebro. Levante suavemente o cérebro para fora do crânio e deixe-o deslizar para dentro da solução gelada. A solução serve para resfriamento rápido e armazenamento temporário.

Repita o procedimento acima para mais dois cérebros. Para obter o tecido da VTA, transfira os cérebros para uma placa de Petri estéril e seca. Usando uma espátula pequena, remova qualquer excesso de fluido deslizando suavemente cada cérebro lateralmente cerca de um centímetro.

Em seguida, use uma lâmina de barbear para remover o tronco encefálico fazendo um corte vertical coronal ao nível do cerebelo. Agora, cole um bloco de ágar em um disco de montagem para estabilização mecânica dos cérebros durante o procedimento de corte. Em seguida, coloque uma fina linha de cola super resistente, alguns milímetros à frente do bloco de ágar no disco, mas evite que a cola toque o ágar usando uma espátula pequena.

Transfira e monte cada polo frontal do cérebro voltado para baixo. Certifique-se de que os polos frontais estejam colados ao disco de montagem e que os lados ventrais toquem o ágar sem resíduos de cola. Isso garante uma estabilização mecânica adequada durante o corte e facilita a remoção das fatias cortadas.

Em seguida, submergir cuidadosamente e fixar o disco de montagem com os cérebros montados em uma bandeja de vibram preenchida com solução de gaze gelada. Então, com uma lâmina de barbear cuidadosamente limpa, cortar seções coronais de 400 micrômetros de espessura do mesencéfalo na frequência de vibração mais alta e com velocidade de avanço relativamente baixa; utilizando uma pipeta de pasta invertida com bulbo de sucção, coletar e transferir as fatias contendo a área tegmental ventral (VTA) para placas de Petri de 35 por 10 milímetros preenchidas com solução de gaze estéril e gelada para seções corticais. Repetir os passos anteriores de corte, mas realizar um corte vertical entre o córtex e o cerebelo e montar os quatro cérebros com o polo frontal voltado para cima.

Colete cerca de três fatias coronais com espessura de 350 micrômetros, começando no nível do estriado. Agora, utilizando uma microtesoura feita de lâminas de barbear quebradas, dissecar sob microscópio estereoscópico seções coronais com cerca de dois milímetros de largura das áreas do córtex frontal e do mesencéfalo que contêm a VTA. Colete a seção de tecido separadamente em pequenos recipientes contendo solução de Gaze resfriada.

Para iniciar o montagem do tecido na câmara MEA na posição inicial, coloque a MEA em temperatura ambiente sob um microscópio estereoscópico com a matriz de eletrodos em foco. Em seguida, centralize uma gota de 25 microlitros de plasma sobre a matriz de eletrodos limpa, livre de poeira e estéril. Usando uma espátula pequena, deslize cuidadosamente uma seção do córtex e da área tegmental ventral (VTA) para dentro da gota de plasma.

Agora coloque a MEA sobre uma placa de resfriamento e refocalize a imagem. Deixe esfriar por cerca de 15 segundos antes de adicionar 25 microlitros de trombina à gota de plasma. Em seguida, usando a ponteira de pipeta da trombina, espalhe cuidadosamente a mistura de plasma e trombina com pequenos movimentos circulares sobre a MEA.

Tenha cuidado para não tocar diretamente o arranjo de eletrodos frágeis. Em seguida, posicione suavemente o córtex sobre o arranjo, com a borda dorsal ao longo da segunda fileira de eletrodos do arranjo. Dessa forma, as camadas superficiais em desenvolvimento acabarão por cobrir o restante do arranjo.

Em seguida, posicione o VTA adjacente à borda ventral da seção do córtex. Agora, tampe e feche parcialmente a câmara MEA para manter alta umidade. Deixe o conjunto do cultivo MEA repousar por cerca de seis minutos dentro da câmara de fluxo laminar à temperatura ambiente para permitir a coagulação, pela trombina plasmática, e a elevação.

Enquanto isso, repita o procedimento para preparar mais três culturas. Em seguida, adicione cuidadosamente, em pequenas gotas, 600 microlitros de meio de cultura às câmaras de cultura, utilizando uma seringa de um cc com agulha de 25 por cinco oitavos de polegada. Em seguida, feche firmemente a câmara MEA e coloque o conjunto de cultura MEA na bandeja de armazenamento oscilante dentro do incubador.

Após dois dias in vitro, adicione 10 microlitros de inibidor de mitose. Em seguida, renove 60% do meio de cultura aos quatro dias in vitro e a cada quatro dias subsequentes. Durante o crescimento normal, o cultivo se aplainará substancialmente e expandirá ligeiramente na direção dorsal.

Devido ao desenvolvimento de camadas corticais superficiais, uma cultura saudável é identificada pelo seu tecido acinzentado opaco em contraste de fase. Por outro lado, vesículas brilhantes e refletivas, característica de células degenerativas mortas cerca de 10 a 12 dias após o preparo das culturas, indicam que estão prontas para gravação e estimulação. Para iniciar uma sessão de gravação, a MEA é transferida da bandeja de armazenamento para o estágio da cabeça de gravação.

Para registrar o potencial de campo local ou LFP, utilize um filtro passa-faixa de um a 200 hertz. A atividade multissunitária também pode ser estudada utilizando um filtro passa-faixa de 300 a 3000 hertz. A atividade espontânea saudável tende a ocorrer em rajadas de tamanhos e durações variados.

Para estudar a relação entre a atividade de potenciais de campo locais (LFP) e a atividade de unidades, podemos calcular as médias acionadas por disparos (spike triggered averages) do LFP. Para essas culturas de córtex, deflexões negativas do LFP estão correlacionadas com descargas neuronais para registrar atividade evocada por estímulos. Primeiro, a forma de onda temporal e a amplitude dos estímulos são especificadas por meio de um software que controla um gerador de estímulos.

Um paradigma de estimulação útil é o choque único controlado por corrente e neutro em carga, com forma de onda quadrada bipolar. Em seguida, seleciona-se um eletrodo, que será usado para entregar os estímulos. As respostas típicas de PCL evocadas pelo estímulo são semelhantes a explosões de atividade espontânea.

A circuito de bloqueio desconecta os amplificadores durante a estimulação para reduzir artefatos de estímulo e prevenir a saturação do amplificador. O eletrodo de estimulação requer vários segundos para se recuperar após a estimulação e, portanto, não pode ser utilizado para registrar atividade de resposta. Na MEA, a atividade tende a surgir em aglomerados espaciotemporais, com atividade em um eletrodo, frequentemente acompanhada por atividade em outros locais.

Ao mesmo tempo, formas de onda típicas do potencial de campo local (LFP) durante esses períodos de atividade são mostradas aqui por meio da sobreposição de três agrupamentos ocorrendo em intervalos de vários segundos entre cada agrupamento. Deflexões negativas do LFP podem ser observadas em vários eletrodos dentro de uma janela de um segundo ao extrair picos de NLFP que ultrapassam um limiar de múltiplos desvios padrão negativos; a atividade na forma dos tempos dos picos de NLFP é convenientemente visualizada em um Rasta, no qual colunas de pontos representam NPS quase coincidentes em diversos eletrodos. A organização espaço-temporal dessa atividade é bastante complexa.

Colunas que parecem mais ou menos homogêneas em baixa resolução temporal são compostas por agrupamentos separados em alta resolução temporal e assim por diante. O surgimento de agrupamentos espaciais, GEOTEMPORAL e de potenciais de campo locais é altamente organizado em redes corticais. Mais especificamente, a organização é invariante em escala para as avalanches neuronais.

Isso é demonstrado pelo cálculo da probabilidade de tamanhos de agrupamentos em uma determinada resolução temporal. Delta T. Aqui, os agrupamentos são compostos por NL FPS que ocorrem nos mesmos ou em intervalos de tempo sucessivos; quando o tamanho de tal agrupamento é expresso pelo número total de NFPS por agrupamento ou pelas amplitudes integradas de NLFP por agrupamento, as distribuições de tamanho dos agrupamentos revelam uma lei de potência com um expoente próximo a menos 1,5. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como dissecar cuidadosamente o tecido cerebral e cultivar culturas em matrizes de múltiplos eletrodos para estudar a auto-organização da atividade neuronal.

Esses métodos também foram utilizados para estudar a relação entre atividade espontânea e atividade evocada por estímulo em redes corticais.